Пищевая химия: учебник для студентов вузов

Характерной особенностью ненасыщенных жирных кислот с изолированной трансэтиленовой связью является наличие в их инфракрасных спектрах полосы поглощения в области 960–970 см–1. Количественное определение трансизомеров в смесях, состоящих из насыщенных, цис- и трансненасыщенных жирных кислот возможно благодаря тому, что максимум полосы поглощения изолированной двойной связи в трансформе не зависит от ее положения в углеродной цепи молекулы, а значения коэффициентов поглощения трансизомеров в этой области значительно выше коэффициентов поглощения соответствующих цисизомеров и насыщенных жирных кислот (рис. 8).

Метод инфракрасной спектроскопии используют для определения массовой доли трансизомеров жирных кислот, содержащих изолированную кратную связь, с уровнем трансизомеров более 5% (ГОСТ Р 52677–2006. «Масла растительные, жиры животные и продукты их переработки. Метод определения массовой доли трансизомеров жирных кислот»).

Рис. 8. Спектр поглощения метиловых эфиров кислот: 1 – элаидиновой; 2 – олеиновой (d = 0,025 мм)

Метод не может быть применен для анализа жиров, содержащих большое количество сопряженных кратных связей, например тунгового масла, в связи с тем, что спектры соединений, в которых двойная связь находится в сопряжении с другими ненасыщенными группами, отличаются от спектров соединений с изолированной транссвязью числом полос и их интенсивностью. Метод ИК спектроскопии используют для анализа жиров, имеющих в своем составе низкомолекулярные жирные кислоты (молочный жир, жиры лауринового типа – кокосовое, пальмовое), представляющих собой смешанные триацилглицериды с длинно- и короткоцепочечными радикалами. Не приемлем метод для продуктов, содержащих функциональные группы, которые дают полосы поглощения или изменяют интенсивность деформационных колебаний С–Н-групп изолированных двойных связей в трансконфигурации с частотой 966–968 см–1. Например, для касторового масла, содержащего рицинолевую и рицинэлаидиновую кислоты.

Определение содержания изолированных трансизомеров жирных кислот в растительных и животных жирах сводится к измерению интенсивности полосы поглощения при 968 см–1 (l = 10,33 m) в спектрах исследуемых образцов жиров и сравнению ее с интенсивностью полос поглощения соответствующего стандартного вещества. Вещества анализируются в виде растворов в четыреххлористом углероде. Съемку спектров анализируемых и стандартных веществ, а также растворителя производят на ИК-спектрометрах с призмой из хлористого натрия в диапазоне 910–1060 см–1 с разрешением 4 см–1 и вычисляют оптическую плотность раствора (А0, ед. оптической плотности) по формуле:

$A_0=\frac{J_0}{J},$

где J0 – расстояние от нулевой линии до соответствующей точки на записи от спектральной кривой источника света;
J – расстояние от нулевой линии до записи спектральной кривой вещества.

Оптическую плотность растворителя (АЭ, ед. оптической плотности) вычисляют по формуле:

$A_{Э}=A_P(1-\frac{a}{0,9}),$

где АР – оптическая плотность растворителя, снятого в кювете с фиксированной оптической длиной, 0,6–1,0 мм;
а – содержание исследуемого вещества в анализируемом растворе, г/мл.
Оптическая плотность пробы (А, ед. оптической плотности) равна

$A=A_0-A_{Э}.$

Коэффициент поглощения вещества (К968) при 968 см–1 вычисляют по формуле:

$K_{968}=\frac{A}{C\times d}$

где А – оптическая плотность раствора вещества при 968 см–1, измеренная по отношению к четыреххлористому углероду в эквивалентной толщине;
С – концентрация анализируемого вещества, г/л;
d – толщина кюветы, см.

Аналогичным образом определяют коэффициенты поглощения в стандартных веществах. В качестве стандартных веществ используют олеиновую, элаидиновую и насыщенные жирные кислоты, а также их метиловые эфиры. Растворы стандартных веществ готовят с использованием калибровочных пикнометров в четыреххлористом углероде. Коэффициент поглощения стандартного вещества рассчитывают на основании результатов измерений оптической плотности ряда стандартных растворов метилэлаидата относительно метилолеата. Коэффициент поглощения метилолеата мал.

Подготовка анализируемой пробы. Анализируемый жир (с кислотным числом не более 2 мг КОН/мл) расплавить на водяной бане при температуре не более чем на 10 оС выше его точки плавления, перемешать, при необходимости отфильтровать через складчатый фильтр. Взвесить на аналитических весах 1 г расплавленного жира в круглодонную колбу с пришлифованной пробкой. Жир растворить в 10 мл гептана и добавить пипеткой 0,5 мл 2 н раствора гидроксида калия в метаноле. Для достижения полноты гидролитического процесса пробирку закрыть пробкой и интенсивно перемешать (две минуты). Раствору дать отстояться в течение пяти минут и отделить путем декантации верхний слой (раствор метиловых эфиров в метаноле) от нижнего (раствор глицерина). Верхний слой, содержащий смесь метиловых эфиров, собрать в круглодонную колбу и отогнать растворитель «досуха» на ротационном вакуумном испарителе в атмосфере инертного газа. Точную навеску смеси метиловых эфиров жирных кислот (около 0,2 г) внести в пикнометр вместимостью 10 мл, растворить в небольшом количестве четыреххлористого углерода и довести объем раствора до метки тем же растворителем.

Обработка спектров. Съемку спектра исследуемого вещества вести в условиях, идентичных для калибровочных растворов. Кювету для жидких проб с окнами из хлористого натрия заполнить раствором смеси метиловых эфиров в четыреххлористом углероде. Вторую кювету заполнить четыреххлористым углеродом (фон). Удалить воздушные пузырьки, снять спектр и преобразовать его в единицы поглощения.

Спектр метиловых эфиров представляет собой наложение спектров транс-, цис- и насыщенных соединений. Цис- и насыщенные изомеры в этом диапазоне имеют слабое поглощение (фон). Для учета фона определить оптическую плотность пробы (с учетом оптической плотности растворителя в эквивалентной толщине) в максимуме полосы поглощения при 968 см–1 и минимумах при 930 – 940 см–1 и 1005 – 1020 см–1. Провести через эти точки базовую линию, как показано на рис. 9). Оптическую плотность пробы (Ас, ед. оптической плотности), скорректированную по базовой линии рассчитать по формуле:

Ас = Аp – Аb ,

где Ap – поглощение пика при 966–980 см–1, ед. оптической плотности;
Ab – поглощение по базовой линии (фон), ед. оптической плотности.

Рис. 9. Пример ИК-спектра метиловых эфиров жирных кислот (способ построения базовой линии)

На основе калибровочных графиков для трансизомеров с содержанием менее 10% или более 10% определить массу метилэлаидата (mЭл, г). Массовую долю изолированных трансизомеров в пересчете на метилэлаидат (МТР, %) вычислить по формуле:

$M_{TP}=\frac{m_{Эл}}{m_{МЭ}}\times 100$,

где mМЭ – масса метиловых эфиров жирных кислот, взятых для приготовления раствора в четыреххлористом углероде, г.

Калибровочные растворы с массовой долей метилэлаидата 2, 4, 6, 8%. В пикнометр вместимостью 10 мл внести компоненты (метилолеат и метилэлаэдат) в последовательности и в соотношении, указанных в табл. 1.2.10.

Таблица 1.2.10. Схема приготовления калибровочных растворов
трансизомеров с массовой долей менее 10%

Номинальная массовая доля трансизомера в калибровочном растворе, %	Стандартный раствор, 10 мг/мл
	Метилэлаидата		Метилолеата
	мл	мг	мл	мг
2	0,2	2,00	9,8	98,00
4	0,4	4,00	9,6	96,00
6	0,6	6,00	9,4	94,00
8	0,8	8,00	9,2	92,00

Объем каждого из калибровочных растворов довести до метки четыреххлористым углеродом.

Калибровочные растворы с массовой долей метилэлаидата 10, 30, 50, 70%. В пикнометр вместимостью 10 мл внести компоненты (метилолеата и метилэлаэдатаолеата) в соотношениях, указанных в таблице 1.2.11. Объем каждого из калибровочных растворов довести до метки четыреххлористым углеродом. Для каждого калибровочного раствора рассчитать точную массу метилэлаидата ($m_{Эл}^I$, мг) с учетом исходного значения навески по формуле:

$m_{Эл}^I=C\times V$,

где С – концентрация растворов стандартов (метилэлаидата и метилолеата), мг/мл;
V – объем растворов стандартов (метилэлаидата и метилолеата), мл.

Таблица 1.2.11. Схема приготовления калибровочных растворов
трансизомеров с массовой долей более 10%

Номинальная массовая доля трансизомера в калибровочном растворе, %	Стандартный раствор, 10 мг/мл
	Метилэлаидата		Метилолеата
	мл	мг	мл	мг
10	1,0	10,00	9,0	90,00
30	3,0	30,00	7,0	70,00
50	5,0	50,00	5,0	50,00
70	7,0	70,00	3,0	30,00

Снять спектры калибровочных растворов для стандартных веществ, определить высоту пика поглощения трансизомеров в области 966–968 см–1, построить базовую линию и скорректировать пик поглощения пробы по ней. Построить калибровочные графики для растворов с содержанием трансизомеров менее 10% и более 10% в координатах: скорректированные по базовой линии пики поглощения (Ас, ед. оптической плотности) – масса метилэлаидата ($m_{Эл}^I$, мг).

Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §четыреххлористый углерод, метилэлаидат, метилолеат, гексан, 2 М метилат натрия, метанол, 2 н раствор гидроксида калия в метаноле; §колбы, круглодонные колбы с пришлифованными пробками, делительные воронки, пипетки, пикнометры (10 мл); §ИК-спектрометр, призмы из хлористого натрия или бромистого калия, ротационный вакуумный испаритель, водяная баня, аналитические весы.

Раствор метилэлаидата (10 мг/мл). Навеску метилэлаидата (0,5 г) взвесить в закрытом бюксе на аналитических весах. Растворить навеску в 5 мл четыреххлористого углерода и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 мл. Довести объем раствора до метки четыреххлористым углеродом.

Раствор метилолеата (10 мг/мл). Навеску метилолеата (0,5 г) взвесить в закрытом бюксе на аналитических весах. Растворить навеску в 5 мл четыреххлористого углерода и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 мл. Довести объем раствора до метки четыреххлористым углеродом.

2 М раствор метилата натрия в метаноле. В закрытом бюксе взвесить на аналитических весах 2,5 г метилата натрия. Навеску метилата растворить в небольшом количестве абсолютного метанола и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 25 мл. Раствор метилата натрия охладить, довести объем до метки абсолютным метанолом. Полученный раствор хранить в холодильнике.

2 н раствор гидроксида калия в метаноле. В мерную колбу вместимостью 100 мл взвесить 11,2 г гидроксида калия, добавить 80 мл метанола и растворить при перемешивании, используя магнитную мешалку. Раствор гидроксида калия охладить до комнатной температуры и довести объем до метки метанолом.

Абсолютирование метанола. Метанол прокипятить в течение 6–8 часов с обратным холодильником над оксидом кальция (30 г оксида кальция на 250 мл метанола). Раствор охладить, заменить обратный холодильник на нисходящий и перегнать метанол, отбирая основную фракцию при температуре 64,7 оС.