Для количественного анализа флавоноидов: флавонолов (рутина, кверцетина), флавонов (апигенина, лютеолина, изовитексина) и флавононов (нарингенин, дигидрокверцетин), используют спектрофотометрический метод, в основе которого лежит определение продуктов взаимодействия флавонолов и флавонов с раствором хлорида алюминия (при длине волны 415 нм), и флаванонов с 2,4-динитрофенилгидразином (при длине волны 495 нм).
Флавоны и флавонолы при взаимодействии с хлоридом алюминий образуются кислотоустойчивые комплексы по кето-группе при С4 и гидроксильным группам при С3, и С5, имеющие максимум поглощения в диапазоне длин волн 415–440 нм. При этом они, имея кратную связь между С2–С3, не взаимодействуют с 2-, 4-динитрофенилгидразином, в то время как флаваноны образуют с последним по карбонильной группе 2-, 4-динитрофенилгидразоны, имеющие максимум поглощения при длине волны 495 нм.
Ход анализа. В плоскодонную колбу со шлифом внести навеску гомогенизированного продукта (1,0 г), добавить 30 мл подкисленного 90%-го раствора этилового спирта, подсоединить обратный холодильник и поместить колбу на кипящую водяную баню. Спустя 30 минут экстракт охладить, надосадочную жидкость перелить в мерную колбу вместимостью 100 мл, а осадок залить новой порцией экстрагента (30 мл подкисленного 90%-го раствора этилового спирта). Экстракт охладить, отфильтровать через воронку Шотта и промыть осадок на фильтре раствором этанола. Фильтраты собрать в мерной колбе вместимостью 100 мл и довести объем раствора до метки раствором этилового спирта.
В градуированную пробирку вместимостью 5 мл внести 0,5 мл экстракта, добавить 1,5 мл 95%-го раствора этанола, 0,1 мл 10%-го раствора хлорида алюминия, 0,1 мл 1 М раствора ацетата натрия и 2,8 мл дистиллированной воды. Смесь выдержать при комнатной температуре в течение 30 минут и измерить оптическую плотность анализируемого раствора на спектрофотометре при длине волны 415 нам в кювете с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения использовать те же реактивы, заменив анализируемый экстракт на 0,5 мл дистиллированной воды.
По величине оптической плотности определить по калибровочному графику для кверцетина концентрацию суммы флавонолов и флавонов. Массовую долю суммы флавонолов и флавонов (СФ, мг %) в анализируемой пробе рассчитать по формуле
где СК – концентрация суммы флавонолов и флавонов, найденная по калибровочному графику для кверцетина, мкг/мл;
V1 – общий объем экстракта, 100 мл;
V2 – объем экстракта, взятый на проведение цветной реакции, 0,5 мл;
10 – коэффициент пересчета в мг%;
m – масса навески исследуемого материала, г.
Для определения флавононов в градуированную пробирку вместимостью 5 мл внести новую порцию 0,5 мл экстракта анализируемого образца, добавить 1,5 мл 95%-го раствора этанола, 0,1 мл раствора 2-, 4-динитрофенилгидразина (10 мг/мл), 0,1 мл 1 М раствора ацетата натрия и 2,8 мл дистиллированной воды. Смесь выдержать при комнатной температуре в течение 30 минут и измерить оптическую плотность калибровочного раствора на спектрофотометре при длине волны 495 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения использовать те же реактивы, заменив анализируемый экстракт на 0,5 мл дистиллированной воды.
По величине оптической плотности определить по калибровочному графику для нарингенина концентрацию флавононов. Массовую долю флавононов (С’Ф, мг %) в анализируемой пробе рассчитать по формуле
где СК – концентрация флавононов, найденная по калибровочному графику для нарингенина, мкг/мл;
V1 – общий объем экстракта, 100 мл;
V2 – объем экстракта, взятый на проведение цветной реакции, 0,5 мл;
10 – коэффициент пересчета в мг%;
m – масса навески исследуемого материала, г.
Построение калибровочного графика кверцетина. Из стандартного раствора кверцетина (100 мкг/мл) в мерных колбах вместимостью 25 мл приготовить 4 калибровочных раствора с концентрацией 20, 40, 60 и 80 мкг/мл. Отобрать пипеткой в мерные колбы соответственно 5, 10, 15, 20 мл рабочего раствора кверцетина и довести объемы калибровочных растворов до метки 80%-ным раствором этанола.
В четыре градуированные пробирки вместимостью 5 мл внести по 0,5 мл соответствующего калибровочного раствора кверцетина, добавить 1,5 мл 95%-го раствора этанола, 0,1 мл 10%-го раствора хлорида алюминия, 0,1 мл 1 М раствора ацетата натрия и 2,8 мл дистиллированной воды. Смесь выдержать при комнатной температуре в течение 30 минут и измерить оптическую плотность калибровочных растворов на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения использовать те же реактивы, заменив калибровочный раствор на 0,5 мл дистиллированной воды. Построить калибровочный график в координатах: оптическая плотность (А415) – содержание кверцетина (СКВ, мкг/мл).
Построение калибровочного графика нарингенина. Из стандартного раствора нарингенина (20 мг/мл) в мерных колбах вместимостью 25 мл приготовить 3 калибровочных раствора с концентрацией 800, 1000 и 2000 мкг/мл. Отобрать пипеткой в мерные колбы соответственно 1,0; 2,5; 5,0 мл рабочего раствора нарингенина и довести объемы калибровочных растворов до метки 80%-ным раствором этанола.
В три градуированные пробирки вместимостью 5 мл внести по 0,5 мл соответствующего калибровочного раствора нарингенина, добавить 1,5 мл 95%-го раствора этанола, 0,1 мл раствора 2-, 4-динитрофенилгидразина (10 мг/мл), 0,1 мл 1 М раствора ацетата натрия и 2,8 мл дистиллированной воды. Смесь выдержать при комнатной температуре в течение 30 минут и измерить оптическую плотность калибровочных растворов на спектрофотометре при длине волны 495 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения. В качестве раствора сравнения использовать те же реактивы заменив калибровочный раствор на 0,5 мл дистиллированной воды. Построить калибровочный график в координатах: оптическая плотность (А495) – содержание нарингенина (СНА, мкг/мл).
|
Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §метанол (ос. ч.), спирт этиловый ректифицированный (95%-ный), 10%-ный спиртовой раствор хлористого алюминия (AlCl3·6H2O), 1%-ный раствор 2,4-динитрофенилгидразин, 1%-ный спиртовой раствор гидроксида натрия (на 70%-ном метаноле), 1 М раствор ацетата натрия; §пипетки; конические колбы со шлифом, обратные холодильники, воронки Шотта, мерная колба вместимостью 100 мл, градуированные пробирки, спектрофотометрические кюветы с длиной оптического пути 10 мм; §спектрофотометр с длиной волны 190–900 нм, аналитические весы, водяная баня. |
Стандартный раствор кверцетина (100 мкг/мл). Навеску кверцетина (10 мг) растворить в 20 мл 80%-го раствора этанола, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем раствора до метки тем же растворителем.
Стандартный раствор нарингенина (20мг/мл). Навеску нарингенина (1 г) растворить в 20 мл 80%-го раствора этанола, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 мл и довести объем раствора до метки тем же растворителем.
Раствор 2,4-динитрофенилгидразин (10 мг/мл). Навеску 1 г динитрофенилгидразина растворить в 2 мл 96%-ной серной кислоты и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл с использованием метанола, довести объем раствора до метки тем же растворителем.
Подкисленный раствор этилового спирта. К 99,5 мл охлажденного 95%-го раствора этилового спирта осторожно по стенке прилить 0,5 мл концентрированной серной кислоты.