Ход анализа. Взвесить точную навеску (1–3 г) растительного высушенного и измельченного сырья в пакетике из фильтровальной бумаги и загрузить в аппарат Сокслета (вместимостью 100 мл). В круглодонную колбу залить хлороформ, подсоединить аппарат Сокслета, обратный холодильник. Экстракцию вести в течение 3 ч до прекращения окрашивания растворителя. После удаления окрашенных соединений пакетик с навеской высушить в вытяжном шкафу до удаления запаха хлороформа.
Содержимое пакетика количественно перенести в круглодонную колбу, добавить 60 мл метилового спирта и подсоединить обратный холодильник. Поместить колбу на кипящую водяную баню и выдержать в течение 30 минут. Полученный экстракт слить в мерную колбу вместимостью 200 мл, а экстракцию повторить дважды с новым количеством спирта. Спиртовые экстракты объединить, довести объем раствора до метки тем же растворителем и отфильтровать.
Отобрать 10 мл фильтрата в круглодонную колбу и отогнать растворитель на ротационном вакуумном испарителе досуха. Остаток растворить в 1 мл метилового спирта и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 25 мл. Для этого колбу ополоснуть трижды небольшими порциями безводного ацетона и довести объем раствора до метки, используя безводный ацетон. Полученный метанольно-ацетоновый раствор отфильтровать.
На проведение цветной реакции отобрать 2 мл метанольно-ацетонового фильтрата в фотоколориметрическую кювету, добавить 8 мл свежеприготовленного лимонно-борного реактива и выдержать смесь в темном месте в течение 10 минут. Измерить оптическую плотность окрашенного раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны 470 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. В качестве раствора сравнения использовать безводный ацетон.
Контрольный раствор на окраску. Отмерить в фотоколориметрическую кювету 2 мл исследуемого метанольно-ацетонового фильтрата и 8 мл безводного ацетона. Измерить оптическую плотность контрольного раствора при аналогичных условиях.
Из величины оптической плотности анализируемого раствора вычесть значение оптической плотности для контрольного раствора. По калибровочному графику определить концентрацию флавонолов в анализируемой пробе. Массовую долю флавонолов (СБФ, мг %) рассчитать по формуле
где С – концентрация флавонолов в анализируемом растворе, найденная по калибровочному графику, мкг/мл;
V1 – общий объем метанольного экстракта, 200 мл;
V2 – объем метанольного экстракта, взятого на анализ, 10 мл;
V3 – объем метанольно-ацетонового раствора, 25 мл;
V4 – объем метанольно-ацетонового фильтрата, взятого на цветную реакцию, 2 мл;
100 – коэффициент пересчета в мг %;
1000 – коэффициент пересчета в мг;
m – навеска исследуемого материала, г.
Построение калибровочного графика. Точную навеску (10 мг) многократно перекристаллизованного рутина растворить в 4 мл абсолютного метилового спирта и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл, используя сухой ацетон. Из стандартного раствора рутина приготовить в шести градуированных пробирках калибровочные растворы с массовой концентрацией 1–10 мкг/мл по схеме, приведенной в таблице.2.3.3. Измерить оптическую плотность калибровочных растворов на фотоэлектроколориметре при длине волны 470 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. В качестве раствора сравнения использовать безводный ацетон.
Построить калибровочный график в координатах: оптическая плотность (А470) – концентрация флавонола (СБФ, мкг/мл).
Таблица 2.3.3. Схема приготовления калибровочных растворов флавонолов
|
Номер калибровочного раствора |
Объем реагентов, мл |
Концентрация |
||
|
Стандартный раствор |
Лимонно-борный реактив |
Безводный ацетон |
||
|
1 |
0,1 |
0,4 |
9,5 |
1 |
|
2 |
0,3 |
1,2 |
8,5 |
3 |
|
3 |
0,5 |
2,0 |
7,5 |
5 |
|
4 |
0,7 |
2,8 |
6,5 |
7 |
|
5 |
0,9 |
3,6 |
5,5 |
9 |
|
6 |
1,0 |
4,0 |
5,0 |
10 |
|
Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §перекристаллизованный рутин, метиловый и этиловый спирт (абсолютный), хлороформ, безводный ацетон, лимонно-борный реактив; §пипетки; круглодонные колбы, обратные холодильники, нисходящие холодильники, водяная баня, аппарат Сокслета, мерные колбы вместимостью 25, 200 мл, градуированные пробирки, фотоколориметрические кюветы с длиной оптического пути 10 мм; §аналитические весы; фотоэлектроколориметр (λ 470 нм). |