Пищевая химия: учебник для студентов вузов

Данный метод применяют для определения в пищевых продуктах как общего содержания рибофлавина, так и всех его форм в отдельности. Пробоподготовку для оценки суммарного содержания всех форм ведут путем ферментативного гидролиза, в этих условиях отщепляется связанная с белком форма рибофлавина. Обработка полученного гидролизата трихлоруксусной кислотой (ТХУ) позволяет высвободить рибофлавин из нуклеотидной формы и удалить белки. Для раздельного определения содержания свободной и мононуклеотидносвязанной форм рибофлавина проводят последовательно кислотный, а затем ферментативный гидролиз флавинадениндинуклеотида.

Ход анализа. Навеску анализируемого продукта (около 3–5 г) тщательно растереть в фарфоровой ступке в небольшом объеме фосфатного буфера (рН 7,8–8).

Ферментативный гидролиз. Гомогенизированную массу количественно перенести в коническую колбу вместимостью 250 мл с использованием фосфатного буферного раствора (рН 7,8–8) с таким расчетом, чтобы общий объем составил не более 100 мл. Проверить рН среды полученной смеси и в случае сдвига рН в кислую область ниже 7 довести рН раствора до 7,8–8.

Добавить в колбу ферментный препарат (трипсин или панкреатин) из расчета 30 мг/г сухого вещества анализируемого продукта и выдержать ее в термостате при температуре 37 оС в течение 12–20 ч. Гидролизат количественно перенести в мерную колбу вместимостью 200 мл, довести объем до метки дистиллированной водой и отфильтровать через складчатый фильтр.

В градуированную на 20 мл пробирку со шлифом отмерить 5 мл полученного фильтрата и добавить 5 мл 20%-го раствора ТХУ. Подсоединить к пробирке обратный холодильник и выдержать ее на кипящей водяной бане в течение 10 минут. Охладить содержимое пробирки до комнатной температуры, отсоединить холодильник и нейтрализовать полученную смесь до рН 6, добавив около 2 мл 5 М раствора гидрофосфата калия (1/5 объема).

Окисление примесей. К нейтрализованному раствору по каплям добавить 3%-ный раствор перманганата калия до появления неисчезающего красного окрашивания. Спустя 10 минут для разрушения избытка внесенного перманганата калия прилить при непрерывном перемешивании по каплям 3%-ный раствор пероксида водорода до исчезновения окраски. К бесцветному раствору добавить 0,2 мл раствора хлорида олова, 0,1 мл 2,5%-го раствора гидросульфита натрия и выдержать смесь на вибросмесителе в течение 10 минут. Объем раствора в градуированной пробирке довести до 15 мл дистиллированной водой. В случае образования мути раствор отфильтровать.

Измерение интенсивности флуоресценции. Замерить флуоресценцию отфильтрованного анализируемого раствора и рабочего раствора рибофлавина, приготовленного на ТХУ, в кюветах флуорометра. Для гашения флуоресценции рибофлавина в обе кюветы добавить по 0,1 г гидросульфита и 0,1 г гидрокарбоната натрия и вновь замерить флуоресценцию. Гашение повторить несколько раз до тех пор, пока показания флуорометра не станут постоянными. Массовую долю всех форм витамина В2 ($C_{B2}^{\Sigma }$, млн–1) рассчитать по формуле

$C_{B2}^{\Sigma }=\frac{0,4(A-A^1)\times V\times V_1}{(A_P-A_P^1)\times m\times V_2},$

где А – среднеарифметическое значение показаний флуорометра для анализируемого образца;
А1– среднеарифметическое значение показаний флуорометра для анализируемого образца после гашения флуоресценции;
АР – среднеарифметическое значение показаний флуорометра для рабочего раствора рибофлавина, приготовленного на ТХУ;
$A_P^1$– среднеарифметическое значение показаний флуорометра для рабочего раствора рибофлавина после гашения флуоресценции, приготовленного на ТХУ;
0,4 – масса рибофлавина в 1 мл рабочего раствора, мкг;
m – масса навески анализируемого продукта, г;
V – общий объем гидролизата, 200 мл;
V1 – объем гидролизата после окисления и восстановления, 15 мл;
V2 – объем фильтрата, взятого на кислотный гидролиз с ТХУ, 5 мл.

Определение кислотногидролизуемого и фосфатазотноотщепляемого рибофлавина. Первоначально определить сумму свободного и мононуклеотидного рибофлавина в кислотном гидролизате, а затем всех форм рибофлавина.

Навеску анализируемого материала (5 г) растереть в фарфоровой ступке с кварцевым песком в 10 мл 0,1 н раствора серной кислоты и количественно перенести с использованием того же растворителя в мерную колбу вместимостью 100 мл. Общий объем смеси не должен превышать 75 мл. Колбу поместить в кипящую водяную баню на 45 минут.

Содержимое колбы охладить до 40 оС, довести рН до 4,5 путем добавления насыщенного раствора уксуснокислого натрия и внести ферментный препарат фосфатазы (из расчета 30 мг/г сухого вещества навески). Ферметирование вести при постоянной температуре в термостате при 37 °С в течение 12–16 часов. После чего полученный гидролизат охладить до комнатной температуры, довести объем раствора до метки (100 мл) и отфильтровать.

Окисление примесей. В градуированную пробирку со шлифом отмерить 8 мл фильтрата и по каплям добавить 3%-ный раствор перманганата калия до появления неисчезающего красного окрашивания. Спустя 10 минут для разрушения избытка перманганата калия прилить при непрерывном перемешивании по каплям 3%-ный раствор пероксида водорода до исчезновения окраски и добавить 0,2 мл раствора хлорида олова, 0,1 мл 2,5%-го раствора гидросульфита натрия. Выдержать смесь на вибросмесителе в течение 10 минут. Объем раствора в градуированной пробирке довести до 15 мл дистиллированной водой. В случае образования мути раствор отфильтровать.

Измерение интенсивности флуоресценции. Замерить флуоресценцию отфильтрованного анализируемого раствора и рабочего раствора рибофлавина, приготовленного на воде. В обе пробирки внести по 0,1 г гидросульфита и 0,1 г гидрокарбоната натрия для гашения флуоресценции рибофлавина и измерить флуоресценцию. Суммарную массовую долю свободного и мононуклеотидносвязанного рибофлавина ($C_{B2}^1$, млн-1) рассчитать по формуле

$C_{B2}^1=\frac{0,4(A-A^1)\times V\times V_1}{(A_P-A_P^1)\times m\times V_2},$

где А – среднеарифметическое значение показаний флуорометра для анализируемого образца;
А1 – среднеарифметическое значение показаний флуорометра для анализируемого образца после гашения флуоресценции;
Ар – среднеарифметическое значение показаний флуорометра для рабочего раствора рибофлавина, приготовленного на воде;
$A_P^1$– среднеарифметическое значение показаний флуорометра для рабочего раствора рибофлавина, приготовленного на воде, после гашения флуоресценции;
0,4 – масса рибофлавина в 1 мл рабочего раствора, мкг;
m – масса навески анализируемого продукта, г;
V – общий объем гидролизата, 100 мл;
V1 – объем гидролизата после окисления и восстановления, 15 мл;
V2 – объем фильтрата, взятого на анализ, 8 мл.

Общее количество рибофлавивина включает прочно связанный с белком витамин В2, флавинадениндинуклеотид, мононуклеотид рибофлавин, свободный рибофлавин. Для расчета массовой доли прочно связанного с белком формы рибофлавина из результата, полученного при ферментативном гидролизе, вычесть результат второго определения (после кислотного гидролиза). Разность в результатах измерений флуоресценции рибофлавина до и после ферментативной обработки во втором определении соответствует массовой доли кислотноотщепляемого флавинадениннуклеотида. Обработка кислотной вытяжки бензиловым спиртом до ферментативного гидролиза позволяет определить массовую долю свободной и мононуклеотидной форм витамина В2.

Основной раствор рибофлавина (40 мкг/мл). Точную навеску кристаллического рибофлавина (0,010 г) растворить в 100 мл 0,05 н раствора серной кислоты в мерной колбе вместимостью 250 мл и довести объем до метки тем же раствором. Полученный раствор перелить в склянку из темного стекла. Срок хранения раствора в холодильнике не более месяца.

Рабочий раствор рибофлавина на ТХУ (0,4 мкг/мл). В мерную колбу вместимостью 100 мл отмерить 37,5 мл 20%-го раствора ТХУ, добавить 25 мл 4 М раствора гидрофосфата калия, 1 мл основного раствора рибофлавина (40 мг/мл) и довести объем раствора до метки дистиллированной водой.

Водный рабочий раствор рибофлавина (0,4 мкг/мл). В мерную колбу вместимостью 100 мл отмерить 1 мл основного раствора рибофлавина, несколько капель толуола и довести объем раствора до метки дистиллированной водой.

Раствор хлорида олова (SnCl2). Навеску хлорида олова (10 г) растворить в 25 мл концентрированной соляной кислоты. В мерную колбу вместимостью 100 мл отмерить 0, 2 мл исходного раствора хлорида олова и довести объем раствора до метки дистиллированной водой.

Раствор гидросульфита натрия (NaS2O4×2Н2О). Навеску гидросульфита натрия (0,25 г) растворить в 10 мл 2%-го раствора гидрокарбоната натрия (NaHCO3).

4 М раствор гидрофосфата калия (К2НРО4). В мерной колбе вместимостью 100 мл растворить навеску гидрофосфата калия (69,6 г) в дистиллированной воде и довести объем раствора до метки.

Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §0,1 н раствор соляной кислоты, 0,1 н, 30%-ные растворы серной кислоты, ледяной уксусной кислоты, основной раствор рибофлавина (40 мкг/мл), рабочие растворы рибофлавина, приготовленные на ТХУ и воде, 20%-ный раствор ТХУ, 2,5%-ный раствор и порошок гидросульфита натрия, насыщенный раствор уксуснокислого натрия, раствор хлористого олова (0,8 мг/мл), 3%-ный раствор пероксида водорода, 3%-ный раствор перманганата калия, 25%-ный раствор гидроксида натрия, 4 М раствор гидрофосфата калия, насыщенный раствор уксуснокислого натрия, фосфатный буфер (рН 7,8–8), ферментные препараты (трипсин или панкреатин, амилоризин, фосфатаза), хлороформ, прокаленный сульфат магния, толуол, гидрокарбонат натрия (NaHCO3), раствор хлорида олова (SnCl2); §пипетки, делительные воронки, фарфоровые ступки с пестиками, мерные колбы, колбы плоскодонные со шлифами, холодильники, воронки Шотта, градуированные пробирки со шлифом; §аналитические весы, флуорометр (с набором светофильтров), водяная баня, термостат, установка для фотолиза.