В основу прямого аналитического определения витамина В2 положена флуоресцирующая способность его окисленной формы в ультрафиолетом свете и отсутствие такой способности у восстановленной формы. При добавлении к водному раствору рибофлавина какого-либо восстановителя исчезают и флуоресценция, и окраска вследствие восстановления рибофлавина до бесцветного лейкорибофлавина, не обладающего флуоресценцией. Недостатком метода является флуоресценция примесей других веществ, которые устраняют путем «гашения» флуоресценции восстановителями.
Для восстановления рибофлавина до лейкоформы используют гидросульфит натрия, не оказывающий воздействия на сопутствующие примеси. По разности флуоресценции обработанных и необработанных гидросульфитом растворов оценивают содержание витамина. Метод не применим для продуктов, содержащих злаковые.
Ход анализа. В плоскодонной колбе вместимостью 250 мл растворить навеску анализируемого продукта (около 5 г) в 150 мл 0,1 н раствора соляной кислоты. Колбу с раствором выдержать на кипящей водяной бане в течение 40 минут для прохождения кислотного гидролиза, а затем охладить до 20 оС. Довести рН среды кислотного гидролизата до 4,5, добавив насыщенный раствор уксуснокислого натрия (5–7 мл). Затем внести 0,1 г ферментного препарата (амилоризина ПХ10, пектаваморина П10Х), 0,5 мл толуола и выдержать смесь в термостате при температуре 37 оС в течение 14–16 часов. Гидролизат охладить до комнатной температуры и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 250 мл, довести объем до метки дистиллированной водой и отфильтровать через складчатый фильтр.
Для определения наличия примесей рибофлавина в ферментном препарате параллельно приготовить холостой опыт аналогично анализируемой пробе. В мерную колбу вместимостью 250 мл отмерить 150 мл 0,1 н раствора соляной кислоты, добавить 5–7 мл насыщенного раствора уксуснокислого натрия (до достижения рН 4,5), 0,1 г ферментного препарата (амилоризина) и 0,5 мл толуола и выдержать смесь в термостате при температуре 37 оС в течение 14–16 часов. Гидролизат холостого опыта охладить до комнатной температуры, довести объем раствора до метки и отфильтровать.
Окисление примесей. Приготовить пять пробирок. В четыре пробирки отмерить по 10 мл отфильтрованного гидролизата анализируемого продукта. В две пробирки добавить по 1 мл дистиллированной воды, в две другие – по 1 мл рабочего раствора рибофлавина (1 мкг/мл). В пятую пробирку отмерить 10 мл фильтрата холостого опыта. Во все пробирки добавить по 1 мл ледяной уксусной кислоты и перемешать. Затем внести окислитель – по 0,5 мл 3%-ный раствор перманганата калия до появления красного окрашивания. Спустя 2 минуты, для окисления избытка перманганата калия, прилить по каплям 3%-ный раствор пероксида водорода до обесцвечивания смеси.
Измерение интенсивности флуоресценции. Провести измерение флуоресценции во всех пяти растворах на флуорометре. Длина волны первичного облучения – 369 нм, вторичного излучения – 520 нм. Провести гашение флуоресценции, для этого в каждую пробирку для восстановления рибофлавина до нефлуоресцирующей формы добавить небольшими порциями по 20 мг порошка гидросульфита натрия и вновь измерить флуоресценцию растворов. Гашение повторить несколько раз до тех пор, пока показания флуорометра не станут постоянными. Массовую долю витамина В2 (СВ2, млн–1) рассчитать по формуле
где А – среднеарифметическое значение показаний флуорометра анализируемого образца без добавления рабочего раствора рибофлавина;
– среднеарифметическое значение показаний флуорометра анализируемого образца без добавления рабочего раствора рибофлавина после гашения флуоресценции;
АХ – среднеарифметическое значение показаний флуорометра холостого опыта;
– среднеарифметическое значение показаний флуорометра холостого опыта после гашения флуоресценции;
АР – среднеарифметическое значение показаний флуорометра анализируемого образца с добавлением рабочего раствора рибофлавина;
– среднеарифметическое значение показаний флуорометра анализируемого образца с добавлением рабочего раствора рибофлавина после гашения флуоресценции;
m – масса навески анализируемого продукта, г;
mД – масса добавленного витамина В2, 1 мкг;
V – общий объем гидролизата, 250 мл;
V1 – объем гидролизата, взятого на окисление, 10 мл.