В основе флуорометрического5 метода анализа витамина В1 в пищевых продуктах лежит реакция окисления в щелочной среде тиамина до тиохрома, который в УФ-свете имеет характерную синюю флуоресценцию, исчезающую при подкислении и вновь возникающую при подщелачивании. В качестве специфического окислителя применяют гексацианоферрат (III) калия.
Образовавшийся желтого цвета тиохром экстрагируют растворителем, не смешивающимся с водой (изобутиловый, изоамиловый спирты). Флуоресценцию полученного раствора измеряют на флуорометре.
Анализ пищевых продуктов, представляющих собой сложные многокомпонентные смеси, требует предварительного разделения и дальнейшую очистку всех фракций, содержащих витамин В1. Поэтому первоначально проводят кислотный, а затем ферментативный гидролиз, в результате чего происходит высвобождение и перевод всех форм витамина В1 в тиамин.
Полученный гидролизат подвергают хроматографическому разделению на катионите СДВ-3, используя в качестве элюента 25%-ный раствор хлорида калия, приготовленный на 0,1 н растворе соляной кислоты. При анализе несложных пищевых систем гидролизат промывают изобутиловым спиртом, который не растворяет витамин В1, но извлекает нежелательные флуоресцирующие примеси. Метод стандартизирован (ГОСТ–30627.5–98 «Продукты молочные для детского питания. Методы измерения массовой доли витамина В1»).
Ход анализа. Навеску анализируемого продукта (около 5–10 г), в зависимости от массовой доли витамина, тщательно растереть в фарфоровой ступке с 10–25 мл 0,1 н раствора соляной кислоты. Гомогенизированную массу количественно перенести в коническую колбу вместимостью 250 мл, используя тот же растворитель (общий объем раствора не должен превышать 150 мл). Поместить колбу в кипящую водяную баню.
По истечении 45 минут колбу вынуть из бани, охладить до температуры 35–40 оС и довести рН среды гидролизата до 4,5, используя насыщенный раствор уксуснокислого натрия (около 5–7 мл). Внести в колбу 0,1 г ферментного препарата амилоризина П10Х (пектаваморина П10Х), 0,5 мл толуола и выдержать полученную смесь в термостате при температуре 37 оС. Спустя 14–16 часов содержимое колбы охладить до комнатной температуры, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 250 мл, довести объем смеси до метки дистиллированной водой и отфильтровать.
Для удаления флуоресцирующих примесей, мешающих анализу, отмерить в делительную воронку 25 мл фильтрата и добавить 25 мл изобутилового спирта. Воронку закрыть пробкой и поместить в вибросмеситель для экстракции на 5 минут. Дождаться полного разделения слоев жидкостей, верхний слой, содержащий флуоресцирующие примеси, оставить. Нижний (водный) слой собрать в мерную колбу вместимостью 25 мл и довести объем раствора до метки дистиллированной водой.
Окисление тиамина до тиохрома. В четыре делительные воронки вместимостью 50 мл отмерить по 5 мл очищенного от флуоресцирующих примесей фильтрата. Добавить в каждую воронку по 2 мл этилового спирта и перемешать. В первую и вторую делительные воронки внести по 1,2 мл окислительной смеси, состоящей из раствора гексацианоферрата (III) калия и гидрокисида калия. В третью и четвертую воронки прилить по 1,2 мл 30%-го раствора гидроксида натрия (холостые пробы). Закрыть воронки пробками, поместить на вибросмеситель и экстрагировать в течение 2 минут.
Во все воронки добавить по 13 мл изобутилового спирта и продолжить встряхивание в течение 3 минут. Оставить воронки в темном месте на 10 минут для разделения слоев жидкости. Нижний слой (водный) слить, а к верхнему слою (изобутилового спирта) добавить по 2 мл этилового спирта для осветления. Смесь встряхнуть, дать отстояться и отфильтровать через бумажный фильтр в кювету флуориметра.
Измерение флуоресценции стандартного раствора тиамина. Отмерить в четыре делительные воронки (вместимостью 50 мл) по 5 мл рабочего раствора тиамин хлорида (1 мкг/мл), добавить по 2 мл этилового спирта и перемешать. Провести окисление стандартных растворов тиамина также как и анализируемых растворов. Измерить флуоресценцию стандартных растворов тиамина после окисления и соответствующих холостых проб (без окислителя), а затем флуоресценцию анализируемых растворов и соответствующих им холостых проб на флуорометре со светофильтрами, имеющими максимум пропускания в области 320–390 нм (В1-первичный, возбуждающего света) и 400–580 нм (В1-вторичный, излучаемого света). Массовую долю витамина В1 (СВ1, млн–1) рассчитать по формуле
где А – среднеарифметическое значение показаний флуорометра для анализируемого продукта;
А1 – среднеарифметическое значение показаний флуорометра для холостой пробы (без окислителя) анализируемого продукта;
АС – среднеарифметическое значение показаний флуорометра для стандартного раствора тиамина;
– среднеарифметическое значение показаний флуорометра для холостой пробы (без окислителя) стандартного раствора тиамина;
m – масса тиамина в 1 мл рабочего раствора, мкг;
m1 – масса анализируемого продукта, г;
V – общий объем гидролизата, 250 мл;
V1 – объем гидролизата, взятого для очистки от примесей, 25 мл;
V2 – объем анализируемого раствора, взятого на окисление тиамина в тиохром, 5 мл;
V3 – объем фильтрата после стадии очистки, 25 мл.
|
Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §0,1 н раствор соляной кислоты, 30%-ный раствор гидроксида калия, 1%-ный раствор гексацианоферрата (III) калия (красной кровяной соли), окислительная смесь (гексацианоферрата (III) калия в гидроксиде калия), основной раствор тиамин хлорида (0,1 мг/мл), рабочий раствор тиамин хлорида (1 мкг/мл), насыщенный раствор уксуснокислого натрия, изобутиловый спирт, этиловый спирт, толуол, ферментный препарат амилоризин П10Х или пектаваморин П10Х (сухой препарат, полученный переосаждением); §пипетки, делительные воронки, фарфоровые ступки с пестиками, стеклянные воронки, мерные колбы, колбы плоскодонные; §аналитические весы, флуорометр (с набором светофильтров), рН- метр, водяная баня, термостат, вибросмеситель. |
1%-ный раствор гексацианоферрата (III) калия (K3[Fe(CN)6]). Точную навеску (1 г) гексацианоферрата (III) калия растворить в 30 мл дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 100 мл и довести объем раствора до метки. Раствор перемешать и перелить в склянку из темного стекла (хранить не более двух суток). Концентрация раствора – 0,01 г/мл.
Окислительная смесь. В стаканчик отмерить пипеткой 2 мл 1%-го раствора гексацианоферрата (III) калия, добавить 10 мл 30%-го раствора гидроксида калия и перемешать. Срок хранения окислительной смеси не более 3 ч.
Насыщенный раствор уксуснокислого натрия. В мерной колбе вместимостью 500 мл взвесить 200 г уксуснокислого натрия (C2H3O2Na× 3H2O), растворить соль в 200 мл дистиллированной воды и довести объем до метки тем же растворителем.
Очистка изобутилового спирта. К 1 л изобутилового спирта добавить 15–20 г активированного угля, встряхнуть и продолжить встряхивать в течение 30 минут. Раствор оставить на сутки, затем отфильтровать через бумажный фильтр и перегнать.
Основной раствор тиамин хлорида (0,1 мг/мл). Точную навеску тиамин хлорида (0,1 г), высушенного в эксикаторе над серной кислотой в течение 10 суток, растворить в мерной колбе вместимостью 1 л в 200 мл дистиллированной воде и довести объем раствора до метки. Раствор хранить в склянке из темного стекла в холодильнике не более 2 месяцев.
Рабочий раствор тиамин хлорида (1 мкг/мл). В мерную колбу вместимостью 100 мл пипеткой отмерить 1 мл основного раствора тиамина (0,1 мг/мл) и довести объем до метки. Хранить не более суток.
5 Флуоресценция (разновидность люминесценции) представляет собой вторичное излучение молекул в короткий период времени непосредственно после поглощения инициирующего ультрафиолетового излучения. Длина волны второго излучения больше, чем инициирующего. Для разбавленных растворов наблюдается линейная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации.