Пищевая химия: учебник для студентов вузов

Для нахождения всей суммы форм аскорбиновой кислоты используют цветную реакцию 2, 4-динитрофенилгидразина с ДАК и ДКГК, которые в отличие от АК в кислой среде образуют окрашенные озазоны, имеющие максимум поглощения в области 520 нм.

Для раздельного определения ДАК и ДКГК смесь обрабатывают унитиолом (димеркаптопропансульфонат натрия, (HSCH2CH(SH)CH2SO3Na)), в этих условиях восстановиться до АК может лишь ДАК. Содержание ДКГК определяют по разности с добавлением и без добавления унитиола.

Ход анализа. Навеску (0,5–1 г) анализируемого материала залить в фарфоровой ступке 10 мл 6%-го раствора метафосфорной кислоты. Гомогенат количественно перенести в мерную колбу вместимостью 25 мл и довести объем смеси до метки тем же растворителем. Содержимое колбы перемешать и через 5 минут отфильтровать через складчатый фильтр в сухую колбу или центрифугировать (20 минут при скорости вращения 3000 об./мин). Отфильтрованный кислотный экстракт в дальнейшем использовать для определения суммы кислот.

Подготовка экстракта на основе раствора унитиола. Навеску (0,5–1 г) анализируемого материала залить в фарфоровой ступке 10 мл 0,002 М раствора унитиола, приготовленного на фосфатном буфере (рН 7). Гомогенат количественно перенести в мерную колбу вместимостью 25 мл и довести объем до метки раствором унитиола. Содержимое колбы перемешать и выдержать при температуре 4 оС в течение 10 минут для полного восстановления ДАК до АК. Осадок отделить путем центрифугирования в течение 20 минут при скорости вращения 3000 об./мин. Осадить белки, добавив к 16 мл фугата 4 мл 5%-го раствора метафосфорной кислоты. Выпавшие белки отделить центрифугированием (15 минут, 3000 об/мин).

Приготовить три градуированные пробирки вместимостью 10 мл со шлифами. В две пробирки внести по 1,5 мл кислотного экстракта. В первую пробирку медленно по каплям добавить 0,001 н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления слабо-розового окрашивания, устойчивого в течение 30 с. В третью пробирку отмерить 1,5 мл экстракта анализируемого продукта, полученного на 0,002 М растворе унитиола. Схема подготовки растворов приведена в табл. 2.2.4.

Таблица 2.2.4. Схема подготовки анализируемых растворов

Номер раствора	1	2	3
Объем кислотного экстракта, мл	1,5	1,5	–
Добавление 2, 6-дихлофенолиндофенола	+	–	–
Объем экстракта на основе унитиола, мл	–	–	1,5

Во все три пробирки прилить по 0,5 мл 2%-го раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Объем полученных растворов довести до 2,5 мл дистиллированной воды. Пробирки закрыть воздушными холодильниками, поместить в термостат и выдержать 10 минут при температуре 100 оС. Содержимое пробирок охладить на ледяной бане и внести в каждую по 2,5 мл 85%-го раствора серной кислоты. Спустя час окрашенные растворы фотоколориметрировать при длине волны 520 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения.

Раствор сравнения приготовить по схеме, аналогичной для первого раствора, заменив кислотный экстракт на 1,5 мл 6%-го раствора метафосфорной кислоты. Прилить 0,5 мл 2%-го раствора 2,4-динитро- фенилгидразина, довести объем до 2,5 мл дистиллированной воды. Пробирку закрыть воздушными холодильниками, поместить в термостат и выдержать 10 минут при температуре 100 оС. После охлаждения на ледяной бане добавить к смеси 2,5 мл 85%-го раствора серной кислоты.

По калибровочному графику определить концентрацию суммы кислот. Оптическая плотность раствора в третьей пробирке (А3) соответствует концентрации ДКГК в анализируемом материале, так как ДАК после добавления унитиола восстанавливается до АК. Оптическая плотность раствора во второй пробирке (А2) соответствует концентрации в анализируемом пробе смеси ДАК и ДКГК. Оптическая плотность раствора в первой пробирке (А1) соответствует содержанию суммы всех кислот, так как АК окисляется до ДАК 2, 6-дихлорфенол-индофенолом. Массовую долю кислот (СДАК+ДКГК, мг %, С АК+ДАК+ДКГК, мг %) с учетом разбавления рассчитать по формулам

$C_{АК+ДАК+ДКГК}=\frac{C_1\times V_1\times 100}{V_2\times m\times 100},$ $C_{ДАК+ДКГК}=\frac{C_2\times V_1\times 100}{V_2\times m\times 100},$

где С1, С2 – концентрация кислот, найденная по оптической плотности раствора в первой (А1) и во второй (А2) пробирках, мкг/мл;
V1 – общий объем вытяжки, 25 мл;
V2 – объем вытяжки, взятой на анализ, 1,5 мл;
m – масса навески анализируемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета в проценты;
1000 – коэффициент пересчета на мг.

При расчете массовой доли ДКГК (СДКГК, мг %) необходимо ввести поправку на разбавление при осаждении белков метафосфорной кислотой.

$C_{ДКГК}=1,2 \frac{C_3\times V_1\times 100}{V_2\times m\times 100},$

где С3 – концентрация ДКГК, найденная по оптической плотности раствора в третьей пробирке (А3), мкг/мл;
1,2 – коэффициент, учитывающий разбавление при осаждении белков метафосфорной кислотой, 20%.

Построение калибровочного графика. Из рабочих растворов аскорбиновой кислоты с концентрацией 20 мкг/мл и 1 мкг/мл приготовить калибровочные растворы по схеме, приведенной в табл. 2.2.5.

Таблица 2.2.5. Схема приготовления калибровочных растворов витамина С

Масса аскорбиновой кислоты, мкг	Объем раствора витамина С, мл
	20 мкг/мл	1 мкг/мл
20,0	1,00	–
15,0	0,75	–
10,0	0,50	–
5,0	0,25	–
1,0	–	1,00

Довести объем калибровочных растворов до 1,5 мл, добавив 6%-ный раствор метафосфорной кислоты. Во все пробирки прилить по каплям 0,001 н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления слабо-розового окрашивания, устойчивого в течение 30 с (переход АК в ДАК). Затем прилить по 0,5 мл 2%-го раствора 2, 4-динитрофенилгидразина и довести объем полученных растворов до 2,5 мл дистиллированной водой.

Пробирки с калибровочными растворами поместить в термостат и выдержать 10 минут при температуре 100 оС. Содержимое пробирок охладить на ледяной бане и внести по 2,5 мл 85%-го раствора серной кислоты. Через час окрашенные растворы колориметрировать при длине волны 520 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения. Раствор сравнения приготовить аналогичным образом, заменив раствор аскорбиновой кислоты на раствор метафосфорной кислоты.

На основе полученных данных построить калибровочный график в координатах: оптическая плотность (А520) – содержание аскорбиновой кислоты (СС, мкг/мл).

Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §0,001 н раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола; 6%-ный раствор метафосфорной кислоты, 2%-ный раствор 2,4-динитрофенилгидразина; 85%-ная серная кислота, концентрированная серная кислота (ρ=1,830 г/мл); тиомочевина ((NH2)2C=S), 0,002 М раствор унитиола (С3Н7О3S3Na) на фосфатном буфере; фосфатный буфер рН 7. §градуированные пробирки вместимостью 10 мл; воздушные холодильники, пипетки, фарфоровые ступки с пестиком, мерные колбы вместимостью 25 мл, фотоколориметрические кюветы с длиной оптического пути 10 мм; §аналитические весы, термостат на 100 оС; ледяная баня; центрифуга (3000 об./мин); фотоколориметр (λ=520 нм).

2%-ный раствор 2,4-динитрофенилгидразина. Навеску в 2 г 2, 4-динитрофенилгидразина растворить при нагревании в 25,2 мл серной кислоты (95,6%, ρ=1,830 г/мл) и добавить 0,25 г тиомочевины. Полученную смесь количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем до метки дистиллированной водой. Срок хранения раствора при 4 оС не более месяца.

0,002 М раствор унитиола на фосфатном буфере. В мерную колбу вместимостью 100 мл внести 0,84 мл 5%-го раствора димеркаптопропансульфонат натрия (С3Н7О3S3Na), объем раствора довести до метки фосфатным буфером (рН 7).

Фосфатный буфер рН 7. К 61,0 мл 0,2 М раствор Na2HPO4 добавить 39,0 мл раствора 0,2 М NaH2PO4.

85%-ный раствор серной кислоты. В фарфоровом стакане вместимостью 1000 мл к 100 мл дистиллированной воды медленно по стенке добавить 900 мл концентрированной (95,6%) серной кислоты.

Стандартный раствор аскорбиновой кислоты (0,1%). Навеску 0,1 г кристаллической аскорбиновой кислоты растворить в 30 мл 6%-го раствора метафосфорной кислоты и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл. Довести объем раствора до метки раствором метафосфорной кислоты. Из стандартного раствора путем последовательного разбавления приготовить рабочие растворы аскорбиновой кислоты

Рабочий раствор аскорбиновой кислоты (20 мкг/мл). В мерную колбу вместимостью 50 мл отобрать пипеткой 1 мл 0,1%-го раствора аскорбиновой кислоты отмерить и довести объем до метки раствором 6%-ной метафосфорной кислоты.

Рабочий раствор аскорбиновой кислоты (1 мкг/мл). Отобрать пипеткой 2,5 мл рабочего раствора аскорбиновой кислоты (20 мкг/мл) в мерную колбу вместимостью 50 мл и довести объем до метки раствором 6%-ной метафосфорной кислоты.