Водные растворы витамина С при нейтральных значениях рН в УФ области спектра дают сильное поглощение при 265 нм, в кислой среде максимум поглощения смещается в область 245 нм. Однако прямой спектрофотометрический анализ витамина С осложнен тем фактом, что в этой области поглощают и другие вещества. Поэтому данный метод применим для анализа безалкогольных напитков и некоторых готовых лекарственных средств, где содержание примесей незначительно.
Для спектрофотометрического анализа в видимой области используют специфически окрашенные продукты, которые образуют L-аскорбиновая кислота и продукты ее окисления. В основе колориметрического метода лежит химическая реакция с 2,6-дихлорфенолиндо-фенолом.
Ход анализа. Навеску (5–10 г) анализируемого материала залить в фарфоровой ступке 20 мл 3%-ным раствором метафосфорной кислоты и растереть до гомогенного состояния. Гомогенизированную пробу количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем смеси до метки тем же растворителем. Содержимое колбы перемешать и через 5 минут отфильтровать через складчатый фильтр в сухую колбу или центрифугировать (в течение 20 минут при скорости вращения 3000 об./мин).
В три пробирки пипеткой отобрать по 10 мл полученного фильтрата или фугата, добавить к каждой по 1 мл 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола и выдержать 30 с. Все три образца колориметрировать при длине волны 530 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. В качестве раствора сравнения использовать смесь из 10 мл 3%-го раствора метафосфорной кислоты и 1 мл 0,001 н раствора 2, 6-дихлор-фенолиндофенола.
По усредненной величине оптической плотности растворов и с использованием калибровочного графика найти массовую долю витамина С (СС, мг %) в анализируемом материале по формуле
где СК – содержание витамина С, найденное по калибровочному графику, мкг/мл;
V – общий объем экстракта, 100 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета в проценты;
1000 – коэффициент пересчета мкг в мг.
Построение калибровочного графика. Из рабочего раствора аскорбиновой кислоты (0,1 мг/мл) в мерных колбах вместимостью 50 мл приготовить пять калибровочных растворов по схеме, приведенной в табл. 2.2.3.
Таблица 2.2.3. Схема приготовления калибровочных растворов витамина С
|
Номер раствора |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Объем рабочего раствора, витамина С, мл |
1,5 |
2,0 |
2,5 |
3,0 |
3,5 |
|
Массовая доля витамина С, мкг/мл |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
Довести объемы калибровочных растворов до метки 3%-ным раствором метафосфорной кислоты и перемешать. В пять пробирок с пришлифованными пробками внести пипеткой по 10 мл калибровочных растворов. Добавить в каждую пробирку по 1 мл 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола. Колориметрировать анализируемые растворы спустя 30 с при длине волны 530 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. В качестве раствора сравнения использовать смесь из 10 мл 3%-го раствора метафосфорной кислоты и 1 мл 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола.
На основе полученных данных построить калибровочный график в координатах: оптическая плотность (А530) – содержание аскорбиновой кислоты (СС, мкг/мл).
Колориметрирование окрашенных растворов
При анализе окрашенных экстрактов, содержащих витамин С, присутствующую АК окисляют краской Тильманса, прибавляя значительный ее избыток. Непрореагирововавший избыток краски извлекают из экстракта растворителем, не смешивающимся с водой (хлороформом или смесью растворителей из толуола и изобутилового спирта). Избыток краски, переходя в органический слой (верхний), окрашивает его в красный цвет. Содержание краски Тильманса в органическом слое определяют колориметрическим методом. По разности между количеством добавленной к экстракту краски и ее остатком после цветной реакции оценивают количество краски, пошедшее на окисление АК.
Ход анализа. Навеску анализируемого продукта (10 г) перенести в фарфоровую ступку, залить 15 мл 2%-го раствора метафосфорной кислоты и растереть фарфоровым пестиком до гомогенного состояния. Гомогенат количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем смеси до метки 2%-ным раствором метафосфорной кислоты. Содержимое колбы перемешать и через 5 минут отфильтровать через складчатый фильтр в сухую колбу или центрифугировать (в течение 20 минут при скорости вращения 3000 об./мин).
В делительную воронку с пришлифованной пробкой пипеткой отобрать 5–10 мл экстракта, прилить 2 мл 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, перемешать и через 2 минуты добавить 10 мл хлороформа. Воронку закрыть пробкой, содержимое аккуратно перемешать и дождаться полного разделения слоев жидкостей.
Отделить органический слой (хлороформа) и колориметрировать его при длине волны 530 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения. Для приготовления раствора сравнения использовать те же компоненты, заменив экстракт на растворитель. Для этого добавить к 5 мл 2%-го раствора метафосфорной кислоты 2 мл 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола, перемешать и через 2 минуты прилить 10 мл хлороформа. Массовую долю витамина С (СС, мг %) в анализируемом материале рассчитать по формуле
где Т – титр 0,001 н раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте, 0,008 мг/мл;
VT – объем 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, 2 мл;
V – общий объем экстракта, 100 мл;
m – масса навески исследуемого материала, г;
А1 – оптическая плотность раствора сравнения;
А2 – оптическая плотность анализируемого раствора;
100 – коэффициент пересчета в мг %.
|
Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §6%-ный раствор метафосфорной кислоты (НnPnO3n), 0,001 н раствор 2, 6-дихлорфенолиндофенола, стандартный раствор аскорбиновой кислоты (0,1%), хлороформ; §пипетки, фарфоровые ступки с пестиком, мерные колбы вместимостью 50 мл, 100 мл, делительные воронки с пришлифованной пробкой, воронки для фильтрования, пробирки, фотоколориметрические кюветы с длиной оптического пути 10 мм; §аналитические весы; секундомер; центрифуга, фотоколориметр (λ=530 нм). |
Раствор 6%-ной метафосфорной кислоты (НnPnO3n). В фарфоровой ступке растереть 60 г метафосфорной кислоты и добавить при перемешивании 940 мл дистиллированной воды. Метафосфорная кислота медленно гидролизуется до ортофосфорной кислоты (Н3РО4), поэтому срок ее хранения в темной склянке с притертой пробкой не более недели. Для приготовления 3%-го раствора к 100 мл 6%-го раствора кислоты добавить 100 мл дистиллированной воды. Раствор готовят в день определения.
Стандартный раствор аскорбиновой кислоты (1 мг/мл). Навеску 0,1 г фармакопейной аскорбиновой кислоты растворить в мерной колбе вместимостью 100 мл в 20 мл 3%-го раствора метафосфорной кислоты и довести объем до метки тем же растворителем. Для приготовления рабочего раствора аскорбиновой кислоты (0,1 мг/мл) отобрать пипеткой 10 мл стандартного раствора аскорбиновой кислоты в мерную колбу вместимостью 100 мл и довести объем раствора до метки 3%-ным раствором метафосфорной кислоты. Из-за неустойчивости раствор готовят перед определением.
0,001 н раствор 2, 6-дихлорфенолиндофенола (0,025%). Навеску 0,25 г 2, 6-дихлорфенолиндофенола растворить в 700 мл дистиллированной воды, перемешать и добавить 300 мл буферной смеси. На следующий день раствор отфильтровать и тщательно перемешать. Определяют титр приготовленного раствора.
Проверка титра 0,001 н раствор 2, 6-дихлорфенолиндофенола. В две конические колбы отмерить пипеткой по 9 мл 3%-ных растворов метафосфорной кислоты или 2%-ной соляной кислоты и по 1 мл 0,01%-го раствора витамина С и быстро оттитровать раствором 2, 6-дихлорфенол-индо-фенола до светло-розовой окраски, не исчезающей в течение 15 с. Аналогичным образом оттитровать 10 мл 3% раствора метафосфорной кислоты (холостая проба).