Витамины D и родственные им стерины дают цветные реакции с различными реагентами, что широко используется при колориметрическом определении витамина. Большинство стеринов, в том числе и витамины D, дают интенсивное окрашивание с серной кислотой (реакция Либермана-Бухарда) с максимумом поглощения при 620 нм. В присутствии ацетилхлорида раствор витамина D дает с 1,3-дихлоргидрином глицерина зеленое окрашивание с максимумом поглощения при 625 нм. С фурфуролом в присутствии трихлоруксусной кислоты витамин D дает цветную реакцию, после нагревания развивается розово-фиолетовое окрашивание с максимумом поглощения при 500–550 нм.
С йодом в этилендихлориде в присутствии витаминов D2, D3 развивается интенсивное желтое окрашивание с максимумом поглощения при 450 нм. Интенсивность окрашивания повышается при добавлении п-хлорбензоата ртути. Реагент обладает высокой специфичностью по отношению к витамину D и более высокой чувствительностью, чем с 1,3-дихлоргидрином глицерина, но менее чем с треххлористой сурьмой. При этом провитамин D и холестерол не мешают определению.
Практическое значение имеет метод, в основе которого лежит цветная реакция с треххлористой сурьмой. Витамины D2, D3 образуют с треххлористой сурьмой в хлороформе окрашенное соединение оранжевого цвета с максимумом поглощения при 520 нм. Реакция не достаточно специфична, но широко используется для количественного анализа продуктов с D-витаминной активностью. Для повышения стабильности реагента добавляют свежеперегнанный ацилхлорид (2,5–3%) или уксусный ангидрид. Эргостерол с треххлористой сурьмой дает красное окрашивание, а холестерол – желтое.
Ход анализа. Точную навеску анализируемого продукта (3–6 г) внести в коническую колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 100 мл, добавить 10 мл 10%-го раствора гидроксида калия и закрыть колбу обратным холодильником и поместить на час в водяную баню при температуре кипения спирта.
После омыления колбу с гидролизатом охладить, отсоединить холодильник и добавить 20 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы количественно перенести в делительную воронку. Колбу трижды ополоснуть небольшими порциями дистиллированной воды и смывы объединить с гидролизатом. Гидролизат, содержащий неомыляемую фракцию, экстрагировать диэтиловым эфиром, используя на каждую экстракцию соответственно 50, 25, 25 мл эфира. Объединенные эфирные вытяжки перенести в делительную воронку и отмыть от щелочи дистиллированной водой, подкисленной соляной кислотой (1–2 капли концентрированной кислоты на литр), до отрицательной реакции промывных вод по фенолфталеину. Общий объем дистиллированной воды, взятой для промывки эфирных вытяжек, не должен превышать 200 мл.
Органический слой (верхний) отделить, собрать в плоскодонную колбу и оставить над осушителем (5–7 г свежепрокаленного сульфата натрия) при периодическом перемешивании. Спустя 30 минут после полного осветления раствора осушитель отфильтровать через воронку Шотта и собрать фильтрат в круглодонную колбу со шлифом. Дважды промыть осушитель на фильтре небольшими порциями диэтилового эфира (по 5 мл) и добавить их к основному фильтрату. Растворитель отогнать на ротационном вакуумном испарителе в атмосфере инертного газа при температуре 30 o С до сухого остатка.
Неомыляемый остаток растворить в сухом хлороформе и количественно перенести в мерную колбу с таким расчетом, чтобы полученный раствор содержал 100–1000 МЕ/мл (2,5–25 мкг/мл) витамина D. Объем раствора в мерной колбе довести до метки тем же растворителем. Отобрать из мерной колбы 1 мл раствора в фотоколориметрическую кювету, добавить три капли свежеперегнанного ацетилхлорида, 6 мл раствора хлорида сурьмы в хлороформе и выдержать ровно 4 минуты после добавления последнего реагента. Измерить оптическую плотность анализируемой смеси при 500 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно контрольного раствора.
Контрольный раствор. Отмерить в фотоколориметрическую кювету 1 мл хлороформа, 6 мл раствора треххлористой сурьмы в хлороформе и три капли ацетилхлорида. По величине оптической плотности определить по калибровочному графику концентрацию витамина. Массовую долю витамина D (СD, млн–1) в анализируемой пробе рассчитать по формуле:
где СК – концентрация витамина D, найденная по калибровочному графику, мкг/мл;
V1 – общий объем хлороформного раствора после экстракции, мл;
V2 – объем хлороформного раствора, взятый на проведение цветной реакции, 1 мл;
m – навеска исследуемого материала, г.
Построение калибровочного графика. Точную навеску кристаллического кальциферола (2,5 мг) растворить в 15 мл хлороформа и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл (с таким расчетом, чтобы содержание витамина D составило 103 МЕ/мл). Из стандартного раствора приготовить пять калибровочных растворов с массовой концентрацией кальциферола от 100 до 1000 МЕ/мл (2,5–25 мкг/мл) по схеме, приведенной в таблице 2.1.11.
Таблица 2.1.11. Схема приготовления калибровочных растворов кальциферола
|
Номер калибровочного раствора |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
Объем стандартного раствора витамина D (103 МЕ/мл), мл |
0,1 |
0,25 |
0,50 |
0,75 |
1,00 |
|
Концентрация витамина D в калибровочном растворе, МЕ/мл |
100 |
250 |
500 |
750 |
1000 |
|
Концентрация витамина D в калибровочном растворе, мкг/мл |
2,5 |
6,25 |
12,50 |
18,75 |
25 |
Для этого в фотоколориметрическую кювету отмерить соответствующее количество стандартного раствора кальциферола, довести объем до 1 мл хлороформом, добавить три капли свежеперегнанного ацетилхлорида, 6 мл раствора хлорида сурьмы в хлороформе. Ровно через 4 минуты после добавления последнего реактива измерить оптическую плотность калибровочных растворов при 500 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора треххлористой сурьмы в хлороформе.
Построить калибровочный график в координатах: оптическая плотность (А500) – содержание витамина D (СD, мкг/мл).
Определение витамина D в молочном жире
Ход анализа. В коническую колбу внести 10 г молочного жира, 40 мл 96%-го этилового спирта и 8 мл 50%-го раствора гидроксида калия. Подсоединить к колбе обратный холодильник и поместить на водяную баню. Полученный гидролизат охладить, отсоединить холодильник и провести экстракцию неомыляемой части с использованием диэтилового эфира по методике, описанной выше.
После удаления растворителя, сухой остаток растворить в 5 мл сухого хлороформа. Из полученного раствора отобрать 1 мл, добавить 6 мл раствора треххлористой сурьмы в хлороформе и 3 капли ацетилхлорида. Измерить оптическую плотность анализируемой пробы при 500 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения. По величине оптической плотности с использованием калибровочного графика определить концентрацию витамина. Массовую долю витамина D (СD, млн–1) в анализируемой пробе рассчитать по формуле:
где СК – количество витамина D, найденное по калибровочному графику, мкг/мл;
V – объем хлороформного раствора неомыляемой части, 5 мл;
m – навеска молочного жира, г.
Определение витамина D в смеси с другими витаминами
Количественному определению витамина D в природных материалах предшествует предварительная очистка образца от соединений, мешающих определению. Для этого необходимо хроматографически удалить витамин А и каротины, осадить спиртовым раствором дигитонина стерины (см. выделение стеринов) в виде дигитонидов (эргокальциферол и холекальциферол дигитонином не осаждаются).
Ход анализа. Точную навеску анализируемого продукта (5–10 г) внести в коническую колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 100 мл, добавить 10 мл 10%-го раствора гидроксида калия и подсоединить обратный холодильник. Провести омыление по вышеописанной методике. Неомыляемый остаток растворить в минимальном объеме хлороформа, перенести количественно в мерную колбу вместимостью 50 мл и довести объем раствора до метки хлороформом. Отобрать строго определенный объем и определить содержание витамина А.
Другую часть (точно измеренную) хлороформного раствора использовать для хроматографирования на бентоните. Поверх адсорбента поместить свежепрокаленный сульфат натрия слоем 10 мм. Адсорбент смочить хлороформом, оставив на поверхности слой растворителя около 0,5 см. Скорость прохождения анализируемого раствора через колонку не должна превышать 40–50 капель/мин. После прохождения анализируемого раствора через колонку адсорбент промыть тремя порциями хлороформа по 15 мл каждая, не допуская при этом смывания в приемник синего кольца, соответствующего витамину А.
Элюаты собрать в колбу и удалить растворитель на ротационном вакуумном испарителе в токе инертного газа. Полученный сухой остаток растворить в минимальном количестве абсолютного этилового спирта, подсоединить к колбе обратный холодильник и нагреть содержимое колбы на водяной бане, не допуская закипания раствора. К нагретому раствору добавить по каплям раствор дигитонина, в 6–8 раз превышающий требуемое количество по уравнению реакции.
Выпавший осадок дигитонида отфильтровать. Фильтрат перенести в делительную воронку и вдвое разбавить дистиллированной водой. Неомыляемую часть экстрагировать диэтиловым эфиром. Дальнейший анализ вести по методике, описанной выше. Попутно с определением витаминов А и D можно определить содержание стеринов весовым методом (см. Определение стеринов весовым методом).
|
Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §10- и 50%-ные растворы гидроксида калия, диэтиловый эфир, абсолютный хлороформ, концентрированная соляная кислота, индикатор – раствор фенолфталеина, осушитель – безводный сульфат натрия, свежеперегнанный ацетилхлорид (CH3COCl), 21–23%-ный раствор хлорида сурьмы (III) в хлороформе, стандартный раствор кальциферола (1000 МЕ/мл витамина D), 96%-ный этиловый спирт, абсолютный этиловый спирт, 1%-ный спиртовой раствор дигитонина, бентонит; §пипетки; конические колбы с пришлифованными пробками вместимостью 100 мл, круглодонные колбы с пришлифованными пробками вместимостью 100 мл, обратные холодильники, делительные воронки, воронки Шотта, мерная колба вместимостью 100 мл, пробирки, фотоколориметрические кюветы с длиной оптического пути 10 мм, бентонитовая колонка (высотой 20–25 см и диаметром 1,5 см); §аналитические весы, ротационный вакуумный испаритель, фотоколориметр (λ=500 нм), водяная баня. |
Приготовление адсорбента. Бентонит залить раствором 2 н соляной кислоты (1 л 2 н раствора соляной кислоты на 40 г бентонита), довести полученную суспензию до кипения, охладить и отфильтровать. Осадок бентонита промыть дистиллированной водой до полного удаления хлора. Промытый бентонит высушить при 120–130 оС и растереть в ступке. Хранить адсорбент в склянке с притертой пробкой.