Пищевая химия: учебник для студентов вузов

Витамин А дает окрашенные соединения сложной структуры с треххлористой сурьмой, треххлористым мышьяком, дихлоргидрином глицерина. На практике для количественного анализа продуктов, содержащих витамин А, используют метод Карра – Прайса.

Определение витамина А по реакции с хлоридом сурьмы

В основе метода Карра – Прайса лежит цветная реакция хлороформного экстракта витамина А с раствором треххлористой сурьмы в присутствии уксусного ангидрида. В результате водоотнимающего действия хлорида сурьмы витамин А превращается в соединение сложного состава синего цвета с максимумом поглощения при 620 нм. Качественная реакция хлорида сурьмы с веществами, обладающими А-витаминной активностью, не специфична – аналогичное окрашивание дают все соединения с сопряженными связями. Образующаяся синяя окраска не стабильна и переходит со временем в розово-фиолетовую, что осложняет анализ и требует строгого соблюдения времени выдерживания до фотометрирования. Кроме того, присутствие влаги в реакционной смеси даже в незначительном количестве вызывает гидролиз хлорида сурьмы до хлороксида сурьмы, который не реагирует с витамином А, а вызывает помутнение смеси. Поэтому для устранения следов влаги в реакционную смесь добавляют уксусный ангидрид.

,

Ход анализа. Точную навеску анализируемого продукта (3–6 г сухого или 15 г жидкого продукта) растворить в 20 мл дистиллированной воды в круглодонной колбе со шлифом вместимостью 250 мл. После полного растворения навески добавить 40 мл этилового спирта и 5–7 мл 50%-го раствора гидроксида калия. Колбу закрыть обратным холодильником и поместить в водяную баню при температуре 85 0С. Для стабилизации витамина А добавить 30–50 мг аскорбиновой кислоты.

Спустя 30 минут колбу с гидролизатом вынуть из бани, охладить и отсоединить холодильник. Содержимое колбы количественно перенести в делительную воронку. Колбу трижды ополоснуть небольшими порциями дистиллированной воды (общий объем 50 мл). Смывы объединить с основным гидролизатом и собрать в делительной воронке. Гидролизат, содержащий неомыляемую фракцию, трижды экстрагировать диэтиловым эфиром, используя на каждую экстракцию по 50 мл эфира. Эфирные вытяжки объединить и отмыть от щелочи дистиллированной водой до отрицательной реакции промывных вод по фенолфталеину. Объем дистиллированной воды не должен превышать 500 мл.

Органический слой (верхний) отделить и собрать в плоскодонную колбу. Эфирный экстракт оставить над осушителем (20 г безводного сульфата натрия) при периодическом перемешивании. Спустя 30 минут осушитель отфильтровать в круглодонную колбу со шлифом через воронку Шотта. Дважды промыть осушитель на фильтре небольшими порциями диэтилового эфира (по 10 мл). Растворитель отогнать на ротационном вакуумном испарителе в атмосфере инертного газа при температуре не выше 40 оС, полученный неомыляемый остаток растворить в 10 мл безводного хлороформа, количественно перенести в мерную колбу вместимостью 25 мл и довести объем до метки хлороформом. Концентрация витамина А должна составить примерно 3 мкг/мл.

В колориметрическую кювету внести 0,4 мл полученного раствора, добавить 1–3 капли уксусного ангидрида, 4 мл насыщенного раствора треххлористой сурьмы в хлороформе и перемешать. Не позднее чем через 10 с измерить оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны 620 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора хлороформа. Массовую долю витамина А (СА, млн–1) рассчитать по формуле:

$C_A=\frac{0,303\times C_K\times V_1}{m},$

где СК – концентрация витамина А, найденная по калибровочному графику, МЕ/мл;
V1 – объем раствора неомыляемой части в хлороформе, 25 мл;
m – навеска исследуемого продукта, г;
0,303 – коэффициент пересчета МЕ в млн–1.

Построение калибровочного графика. Точную навеску кристаллического ретинолацетата, содержащего не менее 105 МЕ/мл, растворить в хлороформе (в мерной посуде) с таким расчетом, чтобы содержание ретинолацетата составило около 100 МЕ/мл. Из стандартного раствора приготовить пять калибровочных растворов с массовой концентрацией ретинолацетата 2–10 МЕ/0,4 мл (табл. 2.1.7).

Таблица 2.1.7. Схема приготовления калибровочных растворов ретинолацетата

Номер калибровочного раствора	1	2	3	4	5
Объем стандартного раствора 100 МЕ/мл, мл	0,5	1,0	1,5	2,0	2,5
Концентрация витамина калибровочного раствора (МЕ/0,4 мл)	2	4	6	8	10

Для этого в градуированные пробирки отмерить необходимое количество стандартного раствора ретинолацетата и довести объем калибровочных растворов до 10 мл хлороформом. В кювету для колориметрирования отобрать пипеткой по 0,4 мл каждого калибровочного раствора, добавить 1–3 капли уксусного ангидрида, 4 мл насыщенного раствора треххлористой сурьмы в хлороформе и не позднее чем через 10 с измерить оптическую плотность при длине волны 620 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Построить калибровочный график в координатах: оптическая плотность (А620) – содержание ретинол ацетата (СА, МЕ/мл).

Определение витамина А по реакции с 1,3-дихлор-2-пропанолом

Метод основан на реакции витамина А с соляной кислотой в среде 1,3-дихлор-2-пропанола (гидриновый реактив). Образующееся при этом соединение имеет фиолетовую или фиолетово-пурпурную окраску. Максимум поглощения лежит в области 550 нм. При взаимодействии витамина А с 1,3-дихлор-2-пропанолом образуется более стабильное соединение, чем с хлоридом сурьмы, сохраняющее окраску постоянной в течение 2–10 минут. Однако чувствительность данного метода ниже, а интенсивность окраски образующегося продукта реакции в пять раз слабее, чем при использовании метода Карра – Прайса (с треххлористой сурьмой).

Ход анализа. Подготовка пробы к анализу аналогична методу Карра – Прайса. Для омыления 5 г анализируемого продукта внести 10 мл 20%-го спиртового раствора гидроксида калия. Неомыляемые вещества экстрагировать диэтиловым эфиром, после удаления эфира полученный остаток растворить в необходимом количестве хлороформа.

В кювету для колориметрирования отмерить пипеткой 1 мл полученного раствора неомыляемого остатка, добавить 2 мл гидринового реактива и спустя 5 минут колориметрировать при длине волны 550 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм относительно рабочего раствора сравнения витамина А (рабочий раствор приготовить из стандартного раствора сравнения). Рассчитать массовую долю витамина А (СА, млн–1) по формуле:

$C_A=\frac{0,03\times V_1\times V_2\times \epsilon }{m\times {\epsilon }_C}\times 1000,$

где e – экстникция исследуемого раствора;
eС – экстникция рабочего раствора сравнения;
V1 – объем неомыляемого остатка в хлороформе, мл;
0,03 – содержание витамина А в стандартном растворе, 0,03 мг/мл;
V2 – общий объем раствора, взятый для колориметрирования, 1 мл;
m – масса навески исследуемого продукта, г;
1000 – коэффициент пересчета в млн–1.

Экстракция витамина А из пищевых продуктов

Провести омыление жира рыб или млекопитающих (навеска – 0,5–1 г) с добавлением 10 мл 0,5 н спиртового раствора гидроксида калия. Далее, как описано в методике выше.

Провести омыление сливочного или топленого масла (навеска – 10–20 г) с использованием 20–40 мл 20%-го спиртового раствора гидроксида калия в течение 1–2 часов при температуре 85–90 оС. К охлажденному раствору добавить 20–40 мл дистиллированной воды и экстрагировать диэтиловым эфиром. На первую экстракцию использовать 75 мл, экстрагента, две последующие по 25 мл. Далее, как описано в методике.

Молоко в количестве 100–200 мл смешать 10–20 мл 60%-го раствора гидроксида калия, добавить 20–40 мл этилового спирта и оставить на 48 часов в темном месте при 20–25 оС при небольшом перемешивании. Неомыляемую часть экстрагировать диэтиловым эфиром в четыре приема. На первую экстракцию использовать 75 мл экстрагента, две последующие по 25 мл. Далее – по методике.

Печень. Гомогенизированную навеску печени (около 1 г) залить 1 мл 60%-го раствора гидроксида калия и 10–20 мл этилового эфира. Гидролиз вести в течение 2–4 часов при температуре 85–90 0С. Далее – по методике.

Яичный желток. К 20 г яичного желтка добавить 6 мл 60%-го раствора гидроксида калия и 10–20 мл этилового спирта. Время гидролиза – 2 часа при температуре 85–90 оС. Далее – по методике.

Витаминизированные кондитерские изделия. Кондитерские изделия (конфеты, пряники) экстрагировать путем настаивания. Для этого 20–50 г исследуемого продукта трижды проэкстрагировать диэтиловым эфиром, затрачивая на каждую экстракцию по 20 мл. Объединенные эфирные вытяжки отфильтровать, растворитель отогнать на ротационном вакуумном испарителе в атмосфере инертного газа. Полученный остаток растворить в хлороформе. Далее – по методике.

Определение витамина А совместно с каротином. Эфирный экстракт осушить и отогнать растворитель в атмосфере инертного газа. Остаток неомыляемых липидов обработать разными способами. Для определения витамина А остаток после удаления диэтилового эфира растворить в хлороформе, для определения каротина – в петролейном эфире.

Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §20, 50%-ный раствор гидроксида калия, этиловый спирт (ректификат), аскорбиновая кислота, диэтиловый эфир, абсолютный хлороформ, индикатор – раствор фенолфталеина, осушитель – безводный сульфат натрия, уксусный ангидрид, раствор хлорида сурьмы (III) в хлороформе), 1,3-дихлор-2-пропаноле (гидриновый реактив), стандартный раствор витамина А (ацетат или пальмитат), стандартный и рабочий растворы сравнения витамина А (метилового фиолетового и сафронина); §пипетки; колбы с пришлифованными пробками вместимостью 250 мл, плоскодонные колбы, обратные холодильники, водяная баня (80 оС), делительные воронки, воронки Шотта, мерная колба вместимостью 100 мл, пробирки, фотоколориметрические кюветы с длиной оптического пути 10 мм; §аналитические весы; водяная баня, ротационный вакуумный испаритель, фотоколориметр (λ 620, 550 нм).

Раствор хлорида сурьмы (SbCl3). Хлорид сурьмы на фильтре промыть хлороформом до тех пор, пока стекающий раствор не станет бесцветным. Промытый реактив высушить в эксикаторе, используя в качестве осушителя концентрированную серную кислоту, в течение суток. Из осушенного реактива приготовить насыщенный раствор в хлороформе.

Раствор хлорида сурьмы (реактив Карра – Прайса). В конической колбе с пришлифованной пробкой вместимостью 500 мл растворить в хлороформе при нагревании на водяной бане (40 оС) 60 г хлорида сурьмы. После растворения осадка раствор охладить до комнатной температуры, внести 6–9 мл уксусного ангидрида. Колбу с раствором хлорида сурьмы закрыть пробкой и оставить в темном месте на 14–18 часов для отстаивания. Полученный прозрачный раствор аккуратно слить в склянку из темного стекла. Срок хранения раствора не более 40 дней при комнатной температуре.

Гидриновый реактив (соляная кислота в 1,3-дихлор-2-пропаноле). Смешать 2 мл концентрированной соляной кислоты с 98 мл 1,3-дихлор-2-пропанола и перелить в склянку из темного стекла. Хранить в холодильнике.

Стандартный раствор сравнения. В мерную колбу вместимостью 1 л внести 10 мг метилового фиолетового и 2,3 мг сафронина и довести объем до метки дистиллированной водой.

Рабочий раствор сравнения (эталонный раствор). К 12 мл стандартного раствора сравнения добавить 13 мл дистиллированной воды и перемешать. Величина экстинкции 1 мл рабочего раствора сравнения соответствует 0,03 мг витамина А.

Определение витамина А методом ТСХ

В колбу для омыления взвесить на аналитических весах навеску измельченного анализируемого продукта 0,05–0,10 г, добавить 20 мл этанола, 100 мг пирогаллола или гидрохинона, 5 мл 60%-го раствора гидроксида калия и подсоединить к колбе обратный холодильник. Омыление вести на глицериновой бане при температуре 90 оС в течение 30 минут.

Колбу с гидролизатом охладить до комнатной температуры, перелить щелочной гидролизат в делительную воронку и провести трехкратную экстракцию гексаном (каждая порция экстрагента по 30 мл). Объединенные экстракты промыть дистиллированной водой до нейтральной реакции (по универсальной индикаторной бумаге) и отфильтровать через безводный сульфат магния в круглодонную колбу со шлифом. Осушитель промыть на фильтре небольшими порциями гексана, промывные растворы объединить с основным фильтратом. Из полученного фильтрата удалить растворитель на ротационном вакуумном испарителе в инертной атмосфере, образовавшийся остаток растворить в хлороформе.

На стартовую линию пластины Silufol нанести 0,1 мл хлороформного раствора неомыляемого остатка. Рядом на линию старта пластины нанести каплю свидетеля – стандартного раствора ретинолацетата (0,5 мкг.). Поместить пластины в хроматографическую камеру. В качестве подвижной фазы использовать смесь хлороформ–гептан (94:6).

После достижения фронтом растворителя верхнего края пластину извлечь ее из камеры, подсушить и «проявить» путем опрыскивания 0,2%-ным раствором хлорного железа. Высушенную пластину поместить в камеру, насыщенную парами йода. Витамин А проявляется в виде темно-синей полосы на голубовато-коричневом фоне. Пластину снова подсушить теплым воздухом до ее полного обесцвечивания (исчезновения следов йода) и обработать 0,5%-ным спиртовым раствором 2, 2’-дипиридила. В итоге на белом фоне пластины должна проявиться розово-красная полоса, соответствующая витамину А. Определить величину Rf пробы относительно со свидетелем (стандартом).

Закрепить окраску образующегося комплекса на пластине, обработав парами аммиака. Окрашенную зону пластины вырезать ножницами и перенести в пробирку с притертой пробкой. В пробирку добавить элюент – смесь этанола, соляной кислоты, фосфорной кислоты и дистиллированной воды в объемных соотношениях 6:3:1:2.

Окрашенный элюата отфильтровать через бумажный фильтр. Оптическую плотность раствора измерить при длине волны 490 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм относительно раствора сравнения (элюент). Содержание витамина определить по калибровочному графику.

Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §96%-ный этиловый спирт, пирогаллол (или гидрохинон), 60%-ный раствор гидроксида кали, гексан, индикаторная бумага, безводный сульфат магния, пластины Silufol, хлороформ, стандартный раствор ацетата ретинола, гептан, 0,2%-ный раствор хлорного железа, кристаллический йод, элюент (смесь этанола, соляной кислоты, фосфорной кислоты и дистиллированной воды в объемных соотношениях 6:3:1:2), 25%-ный раствор аммиака, 0,5%-ный спиртовой раствор 2, 2’-дипиридила; §пипетки; колбы круглодонные с пришлифованными пробками, плоскодонные колбы, обратные холодильники, делительные воронки, воронки Шотта, мерные колбы, пробирки, фотоколориметрические кюветы с длиной оптического пути 10 мм; §аналитические весы; ротационный вакуумный испаритель, фотоэлектроколориметр, хроматографическая камера, глицериновая баня.