Основой для разработки классического метода определения стеринов послужила реакция образования нерастворимого молекулярного комплекса (1:1) между холестеролом и дигитонином.
Стерины, содержащие свободные 3b-оксигруппы и D5-двойные связи, дают аналогичную реакцию с дигитонином, тогда как другие стерины, например 3α-оксипроизводные не вступают в реакцию. Поэтому названный метод имеет значение при определении конфигурации 3-оксигруппы в стеринах.
Реакция с дигитонином используется не только для выделения, но и для количественного определения стеринов. Комплексы стеринов с дигитонином (дигитониды) легко разлагаются при обработке их кислотами или пиридином, выделяющийся при этом дигитонин не мешает количественному определению стеринов методом Либермана-Бурхарда или Златкинса-Зака.
Осаждение стеринов в виде дигитонидов лежит в основе стандартизированного метода обнаружения растительных жиров и масел в молочном жире и молочных продуктах (ГОСТ Р 51471–99. «Жир молочный. Метод обнаружения растительных жиров газожидкостной хроматографией стеринов»). Дигитониды растворяют в смеси формамида с диметилформамидом, экстрагируют пентаном и разделяют методом газожидкостной хроматографии.
Весовой (гравиметрический) метод дает надежный результат при анализе микропроб, содержащих не более 4,5 мг стеринов. Выделение стеринов из жира ведут по методике, описанной для выделения неомыляемых веществ. Навеску жира предварительно омыляют и экстрагируют неомыляемую фракцию диэтиловым эфиром. Сухой остаток после удаления растворителя вновь омыляют и обрабатывают диэтиловым эфиром.
Ход анализа. В плоскодонную колбу внести 10 г жира и прилить 30 мл 2 н спиртового раствора гидроксида калия. Соединить колбу с обратным холодильником и поместить в кипящую водяную баню на один час.
После омыления пробы в течение часа колбу с полученным гидролизатом охладить, добавить 50 мл дистиллированной воды и отсоединить холодильник. Содержимое колбы количественно перенести в делительную воронку и добавить 30 мл диэтилового эфира. Воронку закрыть пробкой и энергично встрянуть несколько раз. Дождаться разделения слоев жидкости и отделить эфирный слой. Экстракцию стеринов повторить пять раз, добавляя каждый раз новую порцию по 30 мл диэтилового эфира.
Эфирные вытяжки объединить, растворитель отогнать на ротационном вакуумном испарителе в атмосфере инертного газа при температуре не выше 80 оС. Полученный сухой остаток вновь омылить и обработать диэтиловым эфиром, как описано выше. Эфирные вытяжки промыть дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод по фенолфталеину, собрать в плоскодонную колбу и оставить над осушителем (сульфатом натрия). После того как эфирный раствор станет прозрачным, его отфильтровать через воронку Шотта. Осушитель на фильтре промыть небольшими порциями диэтилового эфира. Растворитель отогнать на ротационном вакуумном испарителе в атмосфере инертного газа при температуре не выше 80 оС.
Полученный сухой остаток растворить в 50 мл абсолютного спирта. Отобрать 10 мл спиртового раствора, содержащего не более 4,5 мг стеринов, в колбу вместимостью 50 мл и добавить 9 мл 1%-го спиртового раствора дигитонина. Затем раствор перемешать, закрыть колбу пробкой и оставить в холодильнике на 16 часов.
Содержимое колбы отфильтровать через предварительно взвешенную воронку Шотта. Осадок тщательно промыть на фильтре последовательно 10 мл 80%-ным раствором этилового спирта, ацетона, хлороформа, горячей дистиллированной водой. После промывки осадка водой его вновь обработать 10 мл ацетона. Растворитель тщательно отфильтровать, а воронку вместе с осадком высушить до постоянного веса при температуре 105 оС в сушильном шкафу.
Взвесить воронку вместе с осадком. Массовую долю стеринов (ССТ, %) вычислить по формуле:
где m1 – масса сухого остатка после отгонки растворителя, г;
m – масса навески анализируемого материала, г;
100 – коэффициент пересчета в проценты;
0,239; 0,243; 0,253 – гравиметрический фактор для холестерола, ситостерина, суммарных стеринов, соответственно.
Для определения гравиметрического фактора стеринов другого молекулярного веса необходимо учитывать, что одна молекула дигитонина (С56Н92О29 ) соединяется с одной молекулой стерина.
|
Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §1%-ный раствор дигитонина, 80%-ный раствор этилового спирта, ацетон, диэтиловый эфир, хлороформ; §пипетки, воронки Шотта, колбы со шлифами, обратные холодильники; §водяная баня, аналитические весы, ротационный вакуумный испаритель. |
1%-ный раствор дигитонина. К 1 г дигитонина (С56Н92О29) добавить 99 мл 80%-го раствора этилового спирта.