Пищевая химия: учебник для студентов вузов

Лабораторная работа 14. Ферментативный метод определения общего холестерола

В основе метода лежит ферментативное окисление холестерола и дальнейшее колориметрическое определение образующегося пероксида водорода. Данный метод высокоспецифичен, не требует разделения, позволяет определять свободные и этерифицированные стерины и применяется в медицинской практике.

Количественное определение общего холестерола (свободного и связанного) требует проведения предварительной стадии гидролиза либо щелочного, либо ферментативного (холестеринэстераза) для высвобождения свободного холестерола:

Затем свободный холестерол под действием холестеролоксидазы окисляют кислородом воздуха с образованием эквимолярного количества пероксида водорода.

В качестве цветной реакции обычно применяют окисление фенола перекисью водорода под действием пероксидазы до бензохинона, имеющего розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации присутствующего холестерина.

В основе колориметрирического метода лежит реакция Триндера – образование хинониминового красителя в присутствии фенола и 4-аминоантипирена при окислении перексида водорода под действием перокисидазы. Максимум поглощения хиноминового красителя лежит в области 500–520 нм.

Другой колориметрический метод, основанный на реакции автоокисления холестерола, катализируемого холестериноксидазой, предполагает окисление метанола до формальдегида под действием пероксида водорода в присутствии каталазы. Формальдегид в присутствии ацетилацетона и аммиака подвергается циклизации с образованием дигидроацетиллутидина (3,5-диацетил-1,4-дигидролутидин), имеющего максимум поглощения при 405–415 нм.

Ход анализа. Экстракт неомыляемых липидов или хроматографически однородную фракцию анализируемого образца (содержание холестерола не более 7 мг/мл) отмерить в пробирку в количестве 0,01 мл. Компоненты диагностического набора прилить к анализируемой пробе по схеме, приведенной в табл. 1.4.11.

Таблица 1.4.11. Схема приготовления калибровочных растворов холестерола

Наименование реагента

Опытная проба

Калибровочная проба

Контрольная проба

Рабочий раствор реагентов, мл

1,0

1,0

1,0

Анализируемый раствор, мл
Калибратор, мл

0,01


0,01


Вода дистиллированная, мл

0,01

Содержимое пробирок перемешать, выдержать в термостате при температуре 37 оС в течение 10 минут и измерить оптическую плотность опытной (Аопт) и калибровочной (АК) проб против контрольной пробы (Ах) при длине волны 500 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Окраска анализируемых образцов стабильна в течение 30 минут.

Рассчитать содержание холестерола (СХол, ммоль/л) в анализируемой пробе по формуле:

CXол=AОПАK×5,

где Аоп – оптическая плотность опытной пробы;
АК – оптическая плотность калибровочной пробы;
5 – концентрация холестерола в калибраторе, ммоль/л.

Приготовление рабочих растворов реагентов. К содержимому флакона со смесью ферментов и 4-амино-антипирина прилить 5–7 мл из флакона с буферным раствором и аккуратно перемешать круговыми движениями, не допуская пенообразования. Полученный раствор перелить во флакон с буферным раствором. Срок хранения рабочего раствора – 30 суток в холодильнике.

Калибратор готов к применению. После вскрытия флакона с калибратором срок его хранения составляет 6 месяцев в закрытом флаконе в холодильнике.

Необходимые реактивы, посуда, оборудование:

§диагностический набор для определения общего холестерола, физиологический раствор (0,9%-й раствор NaCl);.

§кюветы с длиной оптического пути 10 мм, пипетки;

§аналитические весы, фотоколориметр, термостат с температурой 37 оС, секундомер.

§Состав диагностического набора для определения общего холестерола:

Буферный раствор. Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО4 · хН2О), 0,039 моль/л; натрий фосфорнокислый двузамещенный (NaН2РО4 · хН2О), 0,061 моль/л, фенол, 25,0 ммоль/л, тритон Х-100, 0,77 ммоль/л, натриевая соль холевой кислоты (C24H39O5Na), 1,25 ммоль/л, натрий хлористый (NaCl) 8,0 ммоль/л, азид натрия (NaN3), 7,7 ммоль/л.

Смесь ферментов и 4-аминоантипирина. Холестеролоксидаза, 20 Е; холестеролэстераза, 30 Е; пероксидаза, 100 Е; 4-аминоантипирин (C11H13N3O), 0,05 ммоль.

Калибратор. Калибровочный раствор холестерола, 5,0 ммоль/л (спирт изопропиловый – 100 г/л; натрий хлористый).