В основе метода лежит ферментативное окисление холестерола и дальнейшее колориметрическое определение образующегося пероксида водорода. Данный метод высокоспецифичен, не требует разделения, позволяет определять свободные и этерифицированные стерины и применяется в медицинской практике.
Количественное определение общего холестерола (свободного и связанного) требует проведения предварительной стадии гидролиза либо щелочного, либо ферментативного (холестеринэстераза) для высвобождения свободного холестерола:
Затем свободный холестерол под действием холестеролоксидазы окисляют кислородом воздуха с образованием эквимолярного количества пероксида водорода.
В качестве цветной реакции обычно применяют окисление фенола перекисью водорода под действием пероксидазы до бензохинона, имеющего розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации присутствующего холестерина.
В основе колориметрирического метода лежит реакция Триндера – образование хинониминового красителя в присутствии фенола и 4-аминоантипирена при окислении перексида водорода под действием перокисидазы. Максимум поглощения хиноминового красителя лежит в области 500–520 нм.
Другой колориметрический метод, основанный на реакции автоокисления холестерола, катализируемого холестериноксидазой, предполагает окисление метанола до формальдегида под действием пероксида водорода в присутствии каталазы. Формальдегид в присутствии ацетилацетона и аммиака подвергается циклизации с образованием дигидроацетиллутидина (3,5-диацетил-1,4-дигидролутидин), имеющего максимум поглощения при 405–415 нм.
Ход анализа. Экстракт неомыляемых липидов или хроматографически однородную фракцию анализируемого образца (содержание холестерола не более 7 мг/мл) отмерить в пробирку в количестве 0,01 мл. Компоненты диагностического набора прилить к анализируемой пробе по схеме, приведенной в табл. 1.4.11.
Таблица 1.4.11. Схема приготовления калибровочных растворов холестерола
|
Наименование реагента |
Опытная проба |
Калибровочная проба |
Контрольная проба |
|
Рабочий раствор реагентов, мл |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
|
Анализируемый раствор, мл |
0,01 |
– |
– |
|
Вода дистиллированная, мл |
– |
– |
0,01 |
Содержимое пробирок перемешать, выдержать в термостате при температуре 37 оС в течение 10 минут и измерить оптическую плотность опытной (Аопт) и калибровочной (АК) проб против контрольной пробы (Ах) при длине волны 500 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Окраска анализируемых образцов стабильна в течение 30 минут.
Рассчитать содержание холестерола (СХол, ммоль/л) в анализируемой пробе по формуле:
где Аоп – оптическая плотность опытной пробы;
АК – оптическая плотность калибровочной пробы;
5 – концентрация холестерола в калибраторе, ммоль/л.
Приготовление рабочих растворов реагентов. К содержимому флакона со смесью ферментов и 4-амино-антипирина прилить 5–7 мл из флакона с буферным раствором и аккуратно перемешать круговыми движениями, не допуская пенообразования. Полученный раствор перелить во флакон с буферным раствором. Срок хранения рабочего раствора – 30 суток в холодильнике.
Калибратор готов к применению. После вскрытия флакона с калибратором срок его хранения составляет 6 месяцев в закрытом флаконе в холодильнике.
|
Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §диагностический набор для определения общего холестерола, физиологический раствор (0,9%-й раствор NaCl);. §кюветы с длиной оптического пути 10 мм, пипетки; §аналитические весы, фотоколориметр, термостат с температурой 37 оС, секундомер. §Состав диагностического набора для определения общего холестерола: |
Буферный раствор. Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО4 · хН2О), 0,039 моль/л; натрий фосфорнокислый двузамещенный (NaН2РО4 · хН2О), 0,061 моль/л, фенол, 25,0 ммоль/л, тритон Х-100, 0,77 ммоль/л, натриевая соль холевой кислоты (C24H39O5Na), 1,25 ммоль/л, натрий хлористый (NaCl) 8,0 ммоль/л, азид натрия (NaN3), 7,7 ммоль/л.
Смесь ферментов и 4-аминоантипирина. Холестеролоксидаза, 20 Е; холестеролэстераза, 30 Е; пероксидаза, 100 Е; 4-аминоантипирин (C11H13N3O), 0,05 ммоль.
Калибратор. Калибровочный раствор холестерола, 5,0 ммоль/л (спирт изопропиловый – 100 г/л; натрий хлористый).