Другой колориметрический метод, сравнимый по важности с методом Либермана-Бурхарда – метод Златкинса-Зака. В качестве реактива используют смесь серной и уксусной кислот в соотношении 40:60 (по объему), содержащую хлорное железо.
Чувствительность метода Златкинса-Зака в восемь раз выше метода Либермана-Бурхарда. Пурпурная окраска раствора развивается сразу же после добавления реагента, она более интенсивная, а образующийся комплекс стабильней, чем в случае с реактивом Либермана-Бурхарда. Максимум поглощения окрашенного комплекса наблюдается при 563 нм. Молярные коэффициенты поглощения холестерола и его эфиров идентичны.
Для сложных биологических систем анализ по методу Златкинса- Зака ведут обычно в два этапа, используя предварительно очищенные образцы. Это либо экстракты, либо хроматографически однородные фракции.
Ход анализа. В пробирку с пришлифованной пробкой отмерить 1 мл экстракта неомыляемых веществ в хлороформе, содержащего не более 0,1 мг стеролов. К хлороформному раствору добавить 2 мл этилацетата, 2 мл раствора хлорного железа в уксусной кислоте, перемешать и осторожно прилить 3 мл концентрированной серной кислоты.
Смесь охладить и выдержать в течение 30 минут для развития окраски. Полученный раствор пурпурного цвета колориметрировать при длине волны 540 нм относительно контрольного раствора в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Для приготовления контрольного раствора использовать те же реактивы, заменив раствор липидов на 1 мл хлороформа. Концентрацию стеролов в исследуемой пробе определить по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. Из стандартного 0,01%-го (0,1 мг/мл) раствора эргостерола или холестерола в хлороформе приготовить калибровочные растворы по схеме, приведенной в табл. 1.4.10.
Таблица 1.4.10. Схема приготовления калибровочных растворов стерола
|
Номер калибровочного раствора |
1 |
2 |
3 |
4 |
|
0,01%-ный раствор стерола, мл |
0,1 |
0,3 |
0,6 |
0,9 |
|
Хлороформ, мл |
0,9 |
0,7 |
0,4 |
0,1 |
|
Масса стерола, мкг |
10 |
30 |
60 |
90 |
Объем растворов довести до 1 мл с помощью хлороформа, после чего добавить по 2 мл этилацетата, 2 мл раствора хлорного железа. Растворы перемешать и осторожно добавить к каждому по 3 мл концентрированной серной кислоты. Полученные пурпурного цвета калибровочные растворы охладить и через 30 минут колориметрировать при длине волны 540 нм относительно контрольного раствора в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. По результатам построить калибровочный график.
|
Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §раствор хлорного железа в уксусной кислоте, этилацетат, хлороформ, хлорное железо (FeCl3×4H2O), концентрированная серная кислота, ледяная уксусная кислота, стандартный раствор холестерола или эргостерола (0,01%); §пробирки вместимостью 20 мл с пришлифованной пробкой, кюветы с длиной оптического пути 10 мм, пипетки; §аналитические весы, фотоколориметр. |
Раствор хлорного железа (III). Навеску хлорного железа (FeCl3 ·6H2O) 1,25 г растворить в 10 мл ледяной уксусной кислоты и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл, довести объем раствора до метки ледяной уксусной кислотой.
0,01%-ный раствор эргостерола (или холестерола) в хлороформе. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворить в небольшом количестве хлороформа 0,1 г эргостерола (или холестерола) и довести объем раствором хлороформа до метки. Полученный раствор разбавить хлороформом в отношении 1:10.
1%-ный раствор дигитонина. Навеску дигитонина в количестве 1 г растворить в 50 мл этанола и количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл. Объем довести до метки водой. Полученный раствор можно хранить в темной склянке в течение 6 месяцев.
0,01%-ный раствор холестерола в ледяной уксусной кислоте. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворить в небольшом количестве ледяной уксусной кислоты 0,1 г холестерола и довести объем раствором уксусной кислоты до метки. Полученный раствор разбавить ледяной уксусной кислотой в отношении 1:10.