Выбор метода экстракции во многом зависит от химической природы липидов. Для предотвращения окисления кратных связей процесс экстракции необходимо вести в атмосфере инертного газа с использованием растворителей, свободных от перекисных соединений. Рекомендуемая температура экстракции не должна превышать комнатную. Экстракты липидов не упаривают досуха, а полученный сухой остаток сразу же растворяют в подходящем растворителе.
При экстракции липидов существует вероятность их деградации под действием собственных ферментов, поэтому для инактивации липаз и фосфатаз к экстрагенту добавляют спирт (метиловый или изопропиловый). Однако смеси растворителей, содержащих спирт, извлекают наряду с липидами и нелипидные компоненты (сахара, аминокислоты, минеральные соли). В этом случае от нелипидных компонентов экстракты липидов очищают при помощи колоночной хроматографии, диализа или промывкой водой.
Экстракция липидов из животных тканей
Наиболее эффективной экстракции можно добиться с использованием однофазной системы растворителей – хлороформ–метанол–вода (1:2:0,8). Полученный экстракт разбавляют одним объемом воды и хлороформа. Образующаяся при этом двухфазная система имеет следующий вид: нижний слой – раствор хлороформа – представляет собой практически свободный от загрязнений липидный экстракт. В верхний слой – смесь воды и метанола (1:0,9) – переходят водорастворимые нелипидные примеси.
Ход анализа. Навеску свежей куриной печени (6–7 г) поместить в гомогенизатор, залить 3 мл дистиллированной воды, добавить 30 мл смеси хлороформ–метанол (1:2) и гомогенизировать в течение 2 минут при комнатной температуре. Полученный гомогенат перенести в центрифужную кювету и центрифугировать в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин. Надосадочную жидкость декантировать, а осадок количественно перенести в гомогенизатор с использованием 38 мл смеси хлороформ–метанол–вода (1:2:0,8). Экстракцию повторить при аналогичных условиях. Гомогенат вновь разделить на центрифуге.
Объединенные надосадочные жидкости перенести в делительную воронку, куда добавить 20 мл хлороформа и 20 мл воды. Воронку закрыть пробкой и содержимое аккуратно перемешать, не допуская образования эмульсии. Дождаться полного разделения двухфазной смеси и отделить нижний хлороформный слой. Растворитель отогнать на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 оС в атмосфере инертного газа. Остаток растворить в 10 мл хлороформа.
Экстракция липидов из растительных тканей
Для извлечения липидов из фотосинтезирующих (например, листья шпината) и нефотосинтезирующих (например, морковь) растительных тканей для инактивации ферментов анализируемый материал гомогенизируют в смеси хлороформ – метанол.
Ход анализа. Навеску предварительно нарезанного растительного сырья (100 г) поместить в гомогенизатор, залить 300 мл смеси хлороформ – метанол (1:2 по объему). Смесь гомогенизировать в течение 2 минут при комнатной температуре. Полученный гомогенат отфильтровать на воронке Бюхнера при небольшом вакууме. Осадок с фильтра количественно перенести в гомогенизатор и повторно гомогенизировать с использованием 300 мл смеси хлороформ – метанол (1:2) и 80 мл дистиллированной воды. Гомогенат отфильтровать и промыть осадок на фильтре 150 мл смеси хлороформ – метанол (1:2).
Полученные фильтраты объединить и перенести в делительную воронку, в которую заранее добавить смесь из 250 мл хлороформа и 290 мл дистиллированной воды. Делительную воронку закрыть пробкой и содержимое аккуратно перемешать, не допуская образования эмульсии. Дождаться полного разделения двухфазной смеси и отделить нижний хлороформный слой. Хлороформный слой разбавить бензолом и сконцентрировать на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 оС в атмосфере инертного газа. Остаток растворить в 25 мл хлороформа.
Более стабильные ферменты, например липазы бобовых, сахарной свеклы, денатурируют путем кратковременного кипячения в воде или изопропиловом спирте в течение 1–2 минут.
Ход анализа. Навеску свеженарезанных бобовых листьев (около 100 г) залить 300 мл горячего изопропилового спирта. Смесь гомогенизировать в течение 2 минут при комнатной температуре. Горячий гомогенат отфильтровать на воронке Бюхнера при небольшом вакууме. Осадок промыть на фильтре 200 мл горячего изопропилового спирта и перенести в гомогенизатор. Осадок вторично гомогенизировать в 200 мл смеси хлороформ-изопропиловый спирт (1:1), отфильтровать и промыть осадок на фильтре сначала смесью хлороформ-изопропиловый спирт (1:1), а затем хлороформом. Объединенные фильтраты сконцентрировать на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 оС в атмосфере инертного газа. Остаток растворить в 25 мл хлороформа.
|
Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §хлороформ, метанол, изопропиловый спирт; §круглодонные колбы, обратные холодильники, делительные воронки, пипетки, воронки Бюхнера; §ротационный вакуумный испаритель, водяная баня, аналитические весы, гомогенизатор, центрифуга (3000 об/мин). |