В основе количественного метода анализа витамина В3 лежит реакция пантолактона с гидроксиламином. Пантолактон является конечным продуктом кислотного гидролиза кофермента А вместе с β-меркапто-этиламином, АМФ и β-аланином. С гидроксиламином пантолактон в щелочной среде образует пантоилгидроксамовую кислоту, которая с солями меди (II) дает зеленый осадок соответствующего гидроксамата меди, а с солями железа (III) – красное окрашивание соответствующего гидроксамата железа (максимумом поглощения при 515 нм).
Ход анализа. Исследуемый материал предварительно обезжирить путем кипячения в аппарате Сокслета или настаиванием в среде гексана. Навеску обезжиренного материала массой 1–10 г (содержание витамина В3 около 100–150 мг) тщательно растереть в фарфоровой ступке с небольшим количеством 2 н раствора соляной кислоты до однородной массы. Полученную смесь количественно перенести в плоскодонную колбу вместимостью 200 мл, смывая со ступки и пестика остатки продукта небольшими порциями 2 н раствора соляной кислоты. Общий объем раствора не должен превышать 75 мл. Подсоединить к колбе воздушный холодильник и выдержать ее на водяной бане при температуре 80 оС в течение трех часов. Содержимое колбы охладить до комнатной температуры и отсоединить холодильник. Полученный кислотный гидролизат количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл, довести объем раствора до метки дистиллированной водой, перемешать и отфильтровать через складчатый фильтр.
Для нейтрализации отобрать 30 мл фильтрата в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавить 1–2 капли индикатора – фенолфталеина и внести по каплям 20%-ный раствор гидроксида натрия до получения слабо-розового окрашивания. Прилить 2 мл щелочного раствора гидроксиламина, смесь перемешать и выдержать 5 минут. По каплям прилить 1 н раствор соляной кислоты до исчезновения окраски и довести объем раствора до метки дистиллированной водой.
Отобрать 10 мл нейтрализованной смеси и добавить 2 мл 2%-го раствора хлорида железа (III). Интенсивность развивающейся окраски измерить на фотоколориметре в кюветах с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 540 нм относительно контроля для анализируемого раствора, обработанного аналогичным образом, но без гидролиза.
Стандартный раствор. В плоскодонную колбу вместимостью 100 мл отмерить 1 мл рабочего раствора пантотената кальция (40 мг/мл), добавить 4 мл дистиллированной воды, 3 мл 1 н раствора соляной кислоты. Подсоединить к колбе воздушный холодильник и поместить ее на водяную баню на три часа при температуре 80 оС. По окончании гидролиза содержимое колбы охладить и отсоединить холодильник. К гидролизату добавить 5 мл 2 н раствора гидроксида натрия и 2 мл щелочного раствора гидроксиламина, перемешать и оставить на 5 минут. Полученную смесь оттитровать 2 н раствором соляной кислоты до обесцвечивания в присутствии индикатора – фенолфталеина. Нейтрализованную смесь количественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 мл с использованием дистиллированной воды и довести объем до метки. Из полученного раствора отобрать 10 мл и добавить 2 мл 2%-го раствора хлорида железа (III). Интенсивность окраски стандартного раствора измерить на фотоколориметре в кюветах с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 540 нм относительно контроля для стандартного раствора.
Контрольный опыт провести с теми же реактивами, что и для анализируемого и стандартного растворов, но без применения гидролиза пантотената кальция. Массовую долю витамина В3 (СВ3, мг%) рассчитать по формуле
где A – оптическая плотность анализируемого раствора относительно соответствующего контрольного раствора;
A1– оптическая плотность стандартного раствора относительно соответствующего контрольного раствора;
m – масса навеска исследуемого продукта, г;
m1 – масса навеска пантотената кальция, 40 мг;
1000 – коэффициент пересчета миллиграмм в граммы;
100 – коэффициент пересчета в проценты.
|
Необходимые реактивы, посуда, оборудование: §абочий раствор пантотената кальция (40 мг/мл), 1 и 2 н растворы соляной кислоты, щелочной раствор гидроксиламина, гексан, спиртовой раствор фенолфталеина, 20%-ные и 2 н растворы гидроксида натрия, 2%-ный раствор хлорида железа (III); §аппарат Сокслета, пипетки, фарфоровые ступки с пестиками, мерные колбы, конические колбы, воздушные холодильники; §аналитические весы, спектрофотометр (λ=540 нм), водяная баня. |
Рабочий раствор пантотената кальция (40 мг/мл). Точную навеску пантотената кальция (4 г) растворить в мерной колбе вместимостью 100 мл в 75 мл дистиллированной воды при небольшом нагревании на водяной бане и довести объем раствора до метки дистиллированной водой (1,087 г пантотената кальция соответствует 1 г пантотеновой кислоты). Полученный раствор перелить в склянку из темного стекла. Срок хранения раствора в холодильнике не более двух месяцев.